Aula teórico-prática sobre o uso de um espectrofotômetro manual

o Olá pessoal sou professor Emerson Lima que da Faculdade de Ciências farmacêuticas da UFAM E hoje nós vamos apresentar para vocês uma aula sobre a utilização do espectômetro os pés fotômetro é um equipamento muito importante dentro do laboratório de bioquímica Clínica Talvez seja o equipamento mais importante é lógico que hoje com a modernização dos laboratórios é até raro a gente tem um equipamento como esse que eu tô mostrando aqui para vocês que é um equipamento simples é um equipamento manual Onde você consegue executar de forma bem manual uma técnica bioquímica a maioria dos laboratórios utilizam

os alimentos automatizados os utiliza o equipamento que conseguem fazer o processo de pipetagem automática consegue fazer a reação bioquímica e conseguem liberar um resultado de forma totalmente automatizada isso é grande realidade principalmente aí nas capitais laboratórios de médio e de grande porte para quem atua em laboratórios menores laboratórios de pequeno porte por exemplo aqui na nossa região para quem está no interior do Estado que não tem acesso a esses equipamentos automatizados novamente a rotina é feita ainda em equipamentos como esse equipamentos manuais então é importante o que o analista Clínico saiba utilizar o equipamento Então

a gente tem equipamentos totalmente manuais como esse que eu faço todo o procedimento de forma manual existe os equipamentos semi-automatizados onde ele faz por exemplo processo de aspiração da amostra e já te libera absorbância ou o resultado já se você fizer colocar o fator né filha colocar toda todo o procedimento de cálculo no próprio sistema ele já pode até inclusive te dar o valor da o valor da amostra né o valor real da concentração daquele analito na amostra mais de forma geral os equipamentos manuais são como esse tipo aqui né existe os analógicos como esse

caso existe os dia e na aula de hoje eu vou de mostrar para vocês como seria a utilização de um espectrofotômetro para uma rotina manual é utilizando esse aparelho que eu tenho aqui na eu tô de mostrando para vocês mas ele seria a esse procedimento adaptado a qualquer equipamento de forma manual antes da gente falar propriamente da execução do procedimento eu queria a relembrar um pouquinho para vocês sobre a espectrofotometria Com certeza você Já assistiram à aula teórica sobre técnicas analíticas em laboratório de análises clínicas que a gente tem aqui no canal ou se esqueçam

da disciplina também já devem ter assistido para estar fazendo essa prática e aí eu expliquei na aula para vocês que a espectometria ela tem como princípio O que é uma absorção da luz através de uma solução colorida a gente tem uma faixa do espectro de onda né do espectro eletromagnético e essa faixa inclui a região do visível que vai mais ou menos de 400 há 700 nanômetros e tem uma parte do ultra violeta que é abaixo de 400 ali entre 390 até 200 nanômetros essa faixa do ver não tem cor né a soluções elas são

colorida é uma faixa de comprimento de onda que os nossos olhos ali não conseguem detectar coloração já na faixa do visível ali entre 400 a 700 nanometros eu tenho Obrigatoriamente ali uma e colorida vermelho amarelo azul rosa Violeta Verde tão normalmente essas soluções são coloridas o que que o espectrofotômetro faz ele é capaz de medir a exata absorção de uma determinada região do comprimento de onda por essa solução colorida então uma característica extremamente importante na espectrofotometria a solução aos elida ela tem que ser límpida Ela jamais Pode ser turva então ela tem que ser límpida

porque o que eu vou medir que é absorção da luz ela tem que ser essa luz que é não captada pelo detector né um dúvida que a diferença entre a luz é metida e a luz que é recebida no detector ela tem que ser uma luz que foi absorvida pela cor e do material e não por exemplo por uma turvação então se eu tiver uma solução turva eu não posso ler no espectrofotometria porque essa turvação ela com certeza vai bloquear a parte da luz né mas essa esse bloqueio não se encaixa dentro dos parâmetros para

um uma técnica espectrofotométrica uma outra questão que importante para analista conhecer que eu também falei isso na aula teórica é interessante que o analista Clínico conheça para cada cor qual é a região o que aquela cor absorve por exemplo eu sei que a solução resultante ver avermelhada cor vermelha ela vai absorver na região de 500 nanômetros Eu sei que uma solução resultante amarela ela vai absorver na faixa de 400 nanômetros o quê que isso é importante então se eu estou lendo aqui em 500 nanômetros eu espero que a minha reação após ela ser feita fique

o que vermelha fica avermelhada correto Então se ficar azul opa Há alguma coisa estranha aconteceu eu não deveria estar lendo azul em 500 nanômetros o azul ele vai ser um pouco mais alto na faixa de 600 620 é ou eu fazer fazer uma reação colorimétrica e não ter cor nenhuma a a técnica manda eu ler em 520 nanômetros eu espero ali vermelho indo para o roxo ali o lar é o vermelho do que o roxo e não forma cor alguma alguma coisa estranha aconteceu Provavelmente na minha técnica nalitica ali no meu banho maria o meu

reagente de trabalho não tá funcionando para aquela cor não acontecer então isso é importante eu conhecer eu ter essa noção de que para cada região do espectro principalmente visível eu tenha uma cor resultante esperada naquela região uma outra coisa interessante que tem a ver com isso são as quais a qualidade das cubetas que são utilizadas para essas análises a cubeta é esse recipiente Zinho novamente ele pode ser quadrado ou pode ser Redondo às vezes eu posso utilizar até que eles próprios tubos vinhos de de hemólise para fazer essa leitura desde que eles as frases para

isso mas normalmente eu uso uma cubeta específica que vem junto com o equipamento então a cubeta ela pode a gente tem três materiais principais a gente tem a cubeta de quartzo a cubeta de vidro e uma cubeta de plástico polietileno Qual a diferença entre elas tá lógico na qualidade do material e na interferência que esse material tem sobre a passagem da Luz o material Quartzo É o melhor material ele vai ter muito menos interferência na passagem da luz ele deve ser utilizado para leituras em baixo comprimento de onda a preferencialmente é se eu for fazer

uma leitura por exemplo em 320 ou comprimento de onda nas baixos tipo 280 nanômetros em geral eu não consigo utilizar nem vidro nem conheço nem vidro nem polietileno porque aqui tem muita interferência de absorção nessas regiões então o material mais adequado é o quarto aí eu posso usar o quarto para ler os outros comprimentos de onda mais alto pode tranquilo ele é uma melhor material então por que que eu só não utiliza o quarto para quarta para tudo porque tem a ver com custo também né Essas cubetas de quatro Normalmente eles são bem mais caras

são mais frases então numa rotina muito grande é ou não tem o coberto e suficiente para fazer todas as leituras eu faço ou se eu quebrar uma cubeta isso pode gerar um prejuízo para o laboratório então normalmente ou eu trabalho com uma cubeta de vidro ou até mesmo com a cubeta de quartzo o vidro é um material intermediário onde aí eu posso ler comprimentos intermediários e comprimentos mais altos tranquilamente por exemplo até ultra-violeta acima de 320 330 340-350 imento de ondas bem mais baixos Aí sim aí eu já tenho um problema de interferência na nessa

leitura eo plástico né o plástico a vantagem que é o material mais resistente ele pode cair não vai quebrar É lógico que ele é menos é durável ele pode riscar né isso e trazer problemas na hora da análise e nesse caso por exemplo dessa e fabricante ele até diz que ele pode ser utilizado para a leitura sem 340 nanômetros para frente então é uma cubeta que é totalmente adaptada ao uso por exemplo no laboratório de análises clínicas de bioquímica Clínica onde uma vez que a maioria das técnicas são técnicas colorimétricas Ou seja que formam cor

né que formam cor ao Ao serem realizadas então é normalmente a cubeta utilizada eu posso utilizar essa cubeta de polietileno tranquilamente para a maioria das dosagens posso usar o vidro hipótese posso usar o quartzo quartzo ele é mais utilizados em laboratórios de pesquisa o laboratório onde eu vou fazer uma varredura onde eu tenho comprimento de onda mais baixos e eu preciso ter menos interferência da Leitura naquele meu naquela minha reação naquele meu material tão falando de cubetas é isso falando de do espectro em si como eu já falei a gente tem vários tipos de espectro

a gente tem espectros mais simples e espectros mais complexos é falando aqui do que pode por exemplo desde diferencial mas as principais questões é a questão da lâmpada não existe os espectros a lâmpada que ele emite apenas dos branca e existem spectos com duas lâmpadas de mercúrio e de tungstênio que são uma especificamente para a luz branca e outra para luz ultra-violeta esses pectus com duas lâmpadas ele em geral são melhores Então são mais caros você vai conseguir dizer para ele Qual é a lâmpada que você vai deixar ativa para aquela região que você vai

querer ler né Fazer a leitura uma outro diferencial que tem nos espectros é a o espaço é o fechamento ali do Prisma né porque é seu o espectro ele vai ter uma fonte luminosa ele vai ter um prisma que é como se fosse um filtro do com a onda e ele vai deixar passar apenas uma fração daquele comprimento de onda aí que tá diferença os espectros mais simples Em geral os raios passam em espaços maiores e os cumprimentos e os espectros mais caros com melhor qualidade eles vão deixar passar para ações bem mais finas Dessa

Luz eu posso especificar bandas né bem menores de passagem beleza aí vem a cubeta que eu já expliquei o material a coberta era um procedimento importante o material que está dentro dela que eu já falei que tem que ser uma solução transparente e essa luz ela vai chegar no detector o equipamento normalmente ele ou lê a absorbância eu vou lê a transmitância que é ou a quantidade luz que foi absorvida pela amostra do caso da absorbância e a quantidade de luz que chega no detector a transmitância Ok então elas são inversamente proporcional quanto maior absorbância

menor a transmitância e vice-versa né Maior a transmitância menor a absorbância é isso durante o curso a gente vai trabalhar bastante com essas duas vai ter situações em que a gente vai usar absorbância vai ter situações em que a gente vai usar a transmitância e vocês vão entender entender melhor essas duas unidades de leitura e quando que a gente trabalha com uma e quando a gente trabalha com outro agora eu vou demonstrar para vocês como que seria o uso do espectro e numa análise como é que eu faço para fazer uma leitura isso que a

gente vai mostrar nessa segunda parte da aula então o pessoal eu vou demonstrar para vocês agora eu passo a passo da utilização do espectro fotômetro manual Esse espectrofotômetro é um espectrofotômetro analógico então independente do espectro a primeira coisa que eu vou fazer a utilizar o espectro É lógico ligá-lo em geral eu devo ligar esse especto pelo menos 10 a 15 minutos antes para que a luz a lâmpada estabilize alguns equipamentos eles têm um sensor que me dão a informação de que essa lâmpada está estabilizada e tem automaticamente já fica ali numa pré-análise e quando a

lâmpada estabiliza ele me libera para que eu faça a utilização esse aqui que ela é que tá muito mais simples ele não tem essa função então eu devo conhecer e saber que eu preciso ter esse tempo para que o espectrofotômetro possa atuar na sua melhor forma tão normalmente esse tempo demora de 10 a 15 minutos tão feito isso eu vou fazer a minha ali então eu preciso agora fazer uma leitura de uma solução como eu falei colorida ou na região do ultravioleta primeira coisa que eu preciso saber qual é o comprimento de onda que eu

vou fazer essa leitura EA então eu vou até o equipamento e vou fazer o ajuste do comprimento de onda nesse equipamento aqui ele é um equipamento analógico então eu vou girar esse o dispositivo até se dá eu aqui né até chegar no comprimento de onda que eu desejo fazer a leitura então ajustei o comprimento de onda beleza próxima coisa que eu preciso fazer é definir o modo onde que eu vou fazer a leitura esse equipamento aqui ele me dá a opção de ler em absorbância transmitância ele me dá uma opção de já definir a concentração

seu adicionar aqui um cálculo eu posso fazer isso para quando eu fizer a leitura da minha mostra ele já me deram ele já me der o resultado da concentração daquela mostra ou ele também me dá opção de determinar um fator pelo fator de calibração para multiplicar pelo valor da absorbância no e na grande maioria das vezes a gente utiliza absorbância em alguns casos a transmitância quando você tá numa rotina você pode definir ou concentração ou fator mas na grande maioria das vezes absorbância ou transmitância e agora qual é o próximo passo o próximo passo é

eu será o equipamento então eu vou adicionar uma solução que eu chamo de solução Branco essa solução branco o meu a minha bula vai dizer E qual é essa solução normalmente ela é o reagente de trabalho sem adição de água ou ou ou amostra ou às vezes pedindo pede para você adicionar alguma coisa então isso vai estar descrito na na bula ou às vezes ele pede para zerar o equipamento com água destilada uma coisa interessante importante da gente fazer sempre criar o hábito de fazer uma limpeza da cubeta então eu vou segurar a cubeta sempre

nessa parte que não entra em contato com a que não entre em contato com a luz aqui ó essa parte fosca da cubeta e antes de adicionar no equipamento eu faço uma pega uma gaze e faça uma limpeza Rápida desse material e vou então abrir o compartimento aqui desse ó e vou adicionar no primeira na primeira a primeira caçapinha na casa que tem são quatro espaços na primeira eu vou adicionar o meu branco e na segunda e na terceira eu posso adicionar e na quarta eu posso adicionar o meu padrão o meu controle e as

minhas amostras então é dessa forma eu possa que neste caso fazer três leituras de uma única vez no equipamento né Posso colocar o primeiro ao Branco segundo o padrão terceiro e pode ser uma mostra e quarto uma outra mostra lembrando uma coisa interessante nesse equipamento é eu tenho aqui a luz que vai passar nesse sentido até o detector então a faixa de leitura tem que ser a forma que eu vou colocar a cubeta tem ser de acordo com a com a minha com o direcionamento da luz né Se eu colocar a coberta nesse sentido não

vai haver leitura da amostra porque essa parte da cubeta é Fusca então isso tem que ser observado na Hora da Leitura Beleza então fiz isso coloquei a minha o meu Branco padrão e amostras e eu preciso agora dizer ao equipamento Como que eu faço zerar o equipamento neste equipamento aqui eu aperto nesse botãozinho 10 a ele vai piscar ó e vai aparecer 0,000 isso tem que ser significa que o equipamento ele está calibrado que ele está ajustado então ele ser ou então ele agora me dá a possibilidade de eu fazer a leitura aqui nesse equipamento

como ele tem esse carretelzinho é um e eu posso eu vou fazer puxando essa alavanca eu vou puxar no primeiro espaço ele vai me dar a leitura do branco que não é uma leitura utilizada né na análise é a segunda espaço é a leitura da do meu padrão terceiro a leitura da minha mostra um por exemplo e quatro leitura da amostra 2 então esses valores que estão aparecendo aqui são valores de absorbância eu vou anotar essas absorbâncias e vou utilizá-las para fazer o cálculo da concentração das substâncias que no caso o cálculo da concentração dos

analitos para aquele determinado ensaio por exemplo se eu tiver usando glicose e colesterol ácido úrico eu vou pegar baseado na leitura do padrão e na leitura das amostras eu vou realizar os cálculos nós vamos ver isso em aulas futuras como eu faço para determinar essas concentrações baseadas nessas leituras de absorbância mais de forma geral o uso do espectro é bem simples é esse é basicamente esse uso que eu falei é interessante mostrar uma outra coisa para vocês vou continuar a fazer leituras eu tenho mais amostras eu vou retirar essa cubeta eu vou devolver para o

meu tubo de ensaio e ao colocar uma segunda mostra eu não preciso lavar essa cubeta com água com detergente nada disso eu simplesmente tendo um papel absorvente aqui do lado do espectro eu enxugo essa essa cubeta Coloca essa cubeta em investida aqui no e ele vai enxugar totalmente aqui eu quase totalmente esse excesso de líquido e essa cubeta ela está pronta para uma utilização em uma outra mostra Ah mas não conta a mínima entre amostras É muito raro A não ser que acordar reação seja muito forte a gente tem algumas técnicas como por exemplo creatinina

que ela mancha totalmente a cubeta e neste caso não tem jeito eu tenho que limpar Mas se for por exemplo uma reação como essa você vê que tava com líquido eu tirei você vê que não fica líquido nenhum aqui então neste caso eu poderia utilizar tranquilamente para uma outra mostra que isso não iria fazer essa contaminação cruzada entre amostras então terminou eu posso a guardar o meu desligar o meu equipamento e deixar ele pronto para uma uma outra análises então não tem segredo uso do espectrofotômetro é basicamente isso como eu falei para vocês é interessante

que vocês conheçam utilização cada equipamento tem um pequeno diferencial mas se você souber os passos o que você tem que ter na utilização de uma forma geral você vai saber fazer ao equipamento você vai saber se ela é que você tem que selecionar o comprimento de onda que você tem que fazer a forma correta de você adicionar a cubeta no espaço existem equipamentos também assim de análises clínicas que esse compartimento aqui onde você põe a amostra ele é termostatizado ou seja ele já está numa temperatura de 37° ele pode né ser definido com a temperatura

de 37° Isso é uma o equipamento que a gente chama de cubeta termostatizada isso é importante quando eu faço por exemplo uma reação cinética onde eu preciso manter a temperatura da reação constante durante o ensaio então é imprescindível que eu tenho esse tipo de equipamento é muito importante isso vai dar maior acurácia na minha reação e os casos esse esse compartimento ele pode ser termostatizado ele tem aqui Um uma Peltier né que é uma um tipo de dispositivo que mantém essa toda essa área onde está as amostras a 37 graus isso é importante na bioquímica

e canal se você for escolher e comprar o equipamento de rotina Laboratorial se você puder escolher um que tenha coberto temos batizada é melhor porque ele vai dar para você uma melhor maior segurança Principalmente quando você vai trabalhar com métodos cinéticos que a gente vai ver um pouco mais à frente aqui no curso é esse tipo de de análises é essa dosagem que a gente fez aqui com vocês foi uma dosagem em ponto final onde eu faço uma leitura única naquele tempo então tanto faz eu ler em 5 e 5.5 e 6 o minutos vai

ser praticamente a mesma a mesma leitura então era basicamente isso que eu tinha agradeço você que Assistiu à aula até o final Espero que você tenha gostado desse conteúdo e nos vemos na próxima a E aí [Música]