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e aí oh alô meu povo acho que estamos ao vivo acho que estamos ao vivo vamos ver acho que sim acho que sim vamos ver se não tá dando nem um pepino youtube tá aqui me dizendo que me deu um erro mas acho que não vai ser nada não e fala xará eduardo azevedo tudo bem com você se estivesse aqui na frente hum hum e aí o eduardo você que entrou primeiro dá uma luz aí me fala assim o áudio tá tudo certo o vinícius já falou tatiane também me fala isso o áudio tá bom

parece que sim que tô vendo que tá tudo verdinho as tiver um tempinho aí vocês me avisem por favor o cara não deixa eu ver aqui chatinho deixou preparar para ver o chat aqui eu quero conversar com vocês aí boa valeu pessoal pessoal tava usando aí tá tudo certo boa noite para todo mundo obrigado vocês terem entrado aqui na live na véspera de feriado né show de bola precisar a gente não poder fazer muita coisa ainda tá todo mundo meio preso mas mas é não deixa de ser feriado no feriado aliás feriado para mim é

uma salvação gente eu acho que vale na live passada aí gente olha eu vou falar um negócio para vocês como é difícil cuidar de criança eu minha esposa tá dividindo aqui né cuidado tasmânia no diabo da tasmânia e é muito complicada agora dia inteiro ficar em cima dele resolvendo coisas ontem tava gravando as aulas gravando o curso não é nada expressão gênica por pcr em tempo real foi um curso não sei se alguém aqui tá na turma não mas foi um curso que eu abrir a um mês mais ou menos é um pouco mais de

um mês e agora eu tô gravando os módulos e ontem tava gravando o módulo avançado ontem e antes de ontem começamos cinco da manhã fui para as três horas da manhã porque porque durante a semana que que eu tô cuidando dele não vai mas tá maravilhoso não tem não tem que reclamar não tá todo mundo com saúde aqui tá tudo certo deixa eu ver aqui pessoal tá escrevendo aqui para mim oi beleza e valeu pessoal bem vindo aí todo mundo que entrou em e se lembrar vocês que nós temos nós temos aí um dele aí

zinho de uns 15 20 segundos tá mas vocês vão escrever para mim vai demorar para vocês ouvirem minha resposta tá bom só para vocês lembrarem que tem um delay zinho aqui ó e vamos esperar mais uns minutinhos mas os dois minutos e a gente começa a chover aqui em pisar no pergunta aqui no início onde está ofertando o curso comecei a comprar só que ela ontem o vinícius seguinte o curso que eu é um bom primeira coisa assim joão curso sobre análise pressão gênica por pcr em tempo real é um método específico de análise expressão

gênica por pcr em tempo real na verdade assim não é específico tem uma metodologia ali que viabiliza a utilização das ferramentas de análise expressão gênica por pcr em tempo real para você conseguir obter os resultados de uma maneira muito mais rápida de uma maneira muito mais eficiente com a qualidade melhor que possível que você pode conseguir e eu fiz esse curso para pouquíssimas pessoas um pouquinho mais de um mês aí eu abri as matrículas eu abre e fecha as matrículas rapidinho para manter uma turma bem enxuta e foi que aconteceu eu abri e fechei está

fechado matrícula não dá para participar do curso agora eu tô pensando eu tô recebendo muita solicitação para reabrir as matrículas eu tô considerando real e agora nos próximas semanas aí talvez no próximo mês não sei eu tô pensando sobre isso mas se eu fizer você vai ficar sabendo se você tiver quem tiver cadastrado lá no universo da bemol ponto com não vai ficar sabendo que eu vou avisar por lá tá bom mas por enquanto infelizmente está fechado e não tem como se matricular mas fica ligado aí me obrigado pelo interesse bom então vamos lá quem

já pode começar né para não enrolar aqui para muito também o pessoal e sim não na última live entra entra 15 aquelas pessoas né mandando pornografia mandando um monte de porcaria da escrevendo besteira aí se tiver se por acaso entrar a gente assim na live de hoje como tá a pergunta live né no youtube no instagram essas pessoas que fazem isso as vezes a gente fazer são robôs também e fazem isso é clica em cima do nome da pessoa e aperta banir ou alguma coisa do tipo que a gente fazendo essa ação em conjunto tira

a pessoa da live que ela atrapalha aí na nossa nossa conversa beleza vamos começar se eu trocar aqui a minha tela para o modo padrão e e agora a gente pode começar então lá pessoal se vocês tiverem perguntas manda aí para mim sair pelo chat eu vou visualizar vou dar uma olhadinha aqui no chat de tempos em tempos para tirar a maior quantidade possível de dúvidas mas vezes eu vou passar ah mas de todo jeito é sempre eu dou uma olhada no chat depois e eu respondo individualmente as pessoas ou eu respondo lá na no

no meu nick no youtube mesmo mas naquela sessão de perguntas e respostas que ainda não tem um nome definido mas acho que agora vai sair tá tem uma nova linha editorial do universo sabe o mal que eu falo eu respondo perguntas aí eu mando por lá então vamos lá hoje já fala de acne a sec é uma metodologia dentro do sequenciamento de nova geração e que é a arma longe a mais poderosa pra gente fazer análise do transcriptoma por gente analisar tudo que for relacionado à rna a expressão dna numa célula no tecido essa é

a ferramenta então a gente vai falar sobre ela agora são lembrete rápido aqui ó se alguém tá aqui ainda não se inscreveu lá eu fiz o cadastro universo abrir uol.com faz cadastro é só deixar um e-mail mais nada é rapidinho faz um minutinho menu e aí deixar seu e-mail e eu não vou ficar mandando e-mail spam quem tá na lista sabe de vez em quando quando tem um evento uma hora eu mando alguns meios mais seguidos do outro mas eu não fico atormentando mando coisa é interessante por lá e qualquer novidade que tiver vocês vão

saber por lá também e por um acaso tiver alguém aqui não me segue lá no universo da bemol no instagram vai por lá também porque lá eu coloco os pedacinhos das aulas eu coloco é raciocínios eu fecho raciocínios em pequenos vídeos e diz para o a todo dia tem um vídeo novo no instagram também sei falar na parte de stories que ele sempre dou a agenda da aula de hoje a gente vai falar aqui por uma hora uma hora e pouquinho mais ou menos dependendo da quantidade de perguntas mas não vai passar muito disso não

então a gente vai dividir essa aula em quatro partes a primeira parte 1 overview usam sobre o transcriptoma sobre os métodos de análise de alguns conceitos iniciais que a gente precisa que para entender análise dos dados que é o quarto ponto lá na aula senão não vai fazer sentido nenhum se você não tiver a inicial aí na cabeça aí depois a gente vai seguir com o fluxo de trabalho vamos para entrar na manipulação de rna falar um pouco sobre isso na estação da purificação e aí sim na construção de biblioteca análise dos dados lá no

consumo biblioteca falados como gerar os fragmentos por quê que é importante falar dos adaptadores como a gente faz a manutenção da direção da transcrição a gente vai falar da análise dos dados depois sobre alinhamento montagem quantificação análise funcional tudo isso a gente vai pincelar e ao longo essa aula você tem que saber conceito básico sobre ngs para entender exatamente que eu vou falar porque eu não vou explicar aqui como a gente faz vou sequencialmente em si porque como fazer sequenciamento não interessa na verdade a técnica do sequenciamento ela pouco importa o que importa que como

a gente constrói a biblioteca e como analisa os dados se você quiser saber como o que você tem que fazer o para fazer um sequenciamento de nova geração como funciona a técnica quais são os passos o passo a passo desta técnica em e no canal aqui no youtube tem mais de uma aula dedicada isso tem uma aula específica de mgs que eu falo em detalhes como funcionam duas das tecnologias mais utilizadas aí no brasil então aqui hoje se você não souber nada de emergência se você vai entender mas vai você vai aproveitar melhor se você

souber um pouco mais sobre como funciona o sequenciamento e como é que funciona o fluxo de trabalho de modo direto e vão subir essa hashtag aqui em gente biomol não é difícil olha só esse nosso grupo para mim parar de rolar já mas esse nosso grupo aqui essa essa comunidade que a gente está querendo ela ta crescendo numa velocidade que eu não esperava e de verdade gente eu acho que nós temos juntos com as perguntas que vocês não sabem fazer com interação que vocês fazem nas redes sociais e vai ter coisa nova aí vai ter

grupos telegram vai ter várias coisas que vai poder interagir mas de perto que a gente com certeza tem o potencial de mudar a mentalidade das pessoas o conhecimento das pessoas sobre o mal aqui no brasil porque e as pessoas não têm informação direita tudo muito do drogado e a gente tá concentra nesse lugar só e a gente vai fazer esse negócio você democrático todo mundo vai entender e todo mundo vai fazer biologia melhor para quem quiser fazer vai ter opção de fazer com sem dinheiro que a gente vai falar sobre isso também algum neto bora

chega de enrolação vamos ver se tá tudo certo aqui beleza vou embora é transcriptoma gente até pouquíssimo tempo atrás e é pouco tempo mesmo né que a gente fala de tecnologia sempre há pouco tempo o que que a gente fazia análise individual de gênero tinha que analisar se você quisesse analisar a expressão de um gene ou identificar qualquer variável relacionada a expressão gênica o que era necessário fazer é trabalhar com genes individuais de vez em quando aí você conseguia trabalhar com um grupo de genes quem tinha muito dinheiro muita capacidade de tecnologia e tecnologia disposição

podia fazer talvez em vias metabólicas aí a gente fazer porque até e até por pcr fazer a isso antigamente né uma análise semi-quantitativa mas se fazer porque se eu cheguei até fazer no começo quando eu comecei a trabalhar com meu mal eu fiz uma análise semi-quantitativa por pcr para nós a expressão gênica mas isso você não precisa você pode passar para outras tecnologias como pensar em tempo real por exemplo que aí é uma técnica indica de cima para para codificar nada expressão unigênito só que a pessoa em tempo real de um modo geral que a

gente vai fazer aqui o mundo dos mortais né que a maioria grande é grande maioria dos brasileiros vai ter um equipamento aí de 96 poços talvez um de 384 de vez em quando talvez não da rocha de 480 aí mas mas vai ficar nessa quantidade de raciocínio e conseguia fazer por por corrida né ele tava muito então você é minha analisar um baixíssimo aí uma via metabólica o pati uma vez metabólica o que também não é ruim porque você consegue direcionar o que você quer analisar mas também não muito tempo e as a tecnologia de

marcarem ela permitiu que a gente conseguir finalizar muito mais alvos ao mesmo tempo a gente conseguiu analisar fazer análise quase completas de transcriptoma mesmo porque eu marcarei só que é uma meta uma metodologia cara né é um equipamento caro de a metodologia também não seja tão cara mas o equipamento ele é caro ele não é tão sensível não tem tantas máquinas aqui no brasil então é difícil até acesso um equipamento com esse então fazendo as culturas que toma da sempre foi sempre não mas faz um bom tempo que é possível massa não é a realidade

de muita gente só que com sequenciamento de nova geração com o desenvolvimento e secreção em nova geração com o barateamento do sequenciamento por básico é esse tipo de técnica de metodologia ela foi se expandindo mais ela foi atingido mais pessoas e agora a gente consegue fazer análise de transcriptoma por outras técnicas o meu seja com michael lee ou seja por rms que a gente consegue analisar agora não mais um genezinho um gênio individual ou dois genes ou um atendimento agora que a gente consegue analisar todos os transcritos que analisar o transcriptoma temos que tomar justamente

o conjunto a quantidade de transcritos e uma célula um tecido organismo e um estágio de desenvolvimento específico ou condição fisiológica anti consegue dar um tiro de canhão em olhar para tudo que tá acontecendo na célula em termos de expressão gênica ao mesmo tempo tudo tudo tudo inclusive descobrir coisas novas que ainda não se sabia que não se conhecia que não era anotado a gente consegue fazer isso pela técnica dna segue consegue fazer o pão e colei também então fazer uma análise do transcriptoma a uma abordagem tão ampla como rs aqui é como você tirar uma

foto do que tá acontecendo em termos gerais expressão gênica dentro de uma célula de um tecido você consegue ter um panorama de tudo que tá acontecendo lá dentro quais são os genes que estão sem isso a função como eles estão em que intensidade então você consegue fazer ali vão pensar que um como o quando o áudio quando você consegue fazer tudo isso o combo o homem ea céu né eu pensei que você tá na lizando o como você consegue fazer o corpo que você não vai mais a sua expressão gênica você vai analisar outros fatores

transcricionais relacionados na regulação da expressão gênica o quanto também o que você consegue quantificar e que mais falei o como quando onde é isso daí você entendeu a gente consegue fazer uma análise muito muito anta quando a gente faz análise de transcriptoma e o que que é né análise temos que tomar que quer o transcrito porque a gente tá a gente tende quando vai aprender pelo menos está começando do longe amor é claro na faculdade de pensar muito em dna a gente pensa muito de lá porque análise de dna nas ele é utilizada no mercado

químico muita muita frequência a gente pensa muito em delinear e o dna tem tudo ali dentro tem toda informação o dna é o genoma é o conjunto e marco zenni áudio a régua toda a informação para o desenvolvimento de um organismo para geração de uma pessoa para como é que você sabe muito bem isso daí só que nem tudo que está no genoma nem tudo que está presente na molécula de dna é utilizado nem tudo que é utilizada utilizado ao mesmo tempo e tudo que é utilizado ao mesmo tempo é utilizado na mesa na mesma

intensidade tanto tudo isso varia existem regiões de um genoma que são genes que elas podem ser ativadas ou desativadas de acordo com a necessidade do organismo na célula do tecido que são regiões que podem ser recrutados para desempenhar alguma função ali em algum momento se ele seja lá o que for essas regiões são chamadas em genes e um gênio recrutado quando ele é ativo quando ele é expresso ele vai produzir uma molécula de rna é um mensageiro que aparece aí não não confunda render mensageiro mas a moto a gente ela pode ser justamente um mensageiro

porque ela vai copiar naquela informação está armazenada no dna e o devassa informação levar esse código para ser utilizado em momento algum lugar em uma célula pode ser para traduzir uma proteína pode ser para fazer uma estrutura funcional pode ser para regular a expressão gênica vai ter alguma função aquele rna aquele jeito que foi expresso e produzir um rma vai ter alguma função e esse rna que ele é produzido no processo de transcrição ele é chamado de transcrito tão análise do transcriptoma é justamente analisar todos esses transcritos que estão é preso marcelo cirino formalizando o

perfil de expressão gênica de uma célula de um tecido num determinado momento e uma determinada condição a esse rna mensageiro e algumas situações se for um rna mensageiro né já pode fora de qualquer em aqui mas aqui o rna mensageiro por exemplo ele pode sofrer um processamento ou explícito em isso eu tô mostrando isso aqui pra gente vai falar disso lá na análise dos dados que que acontece o a estrutura do rna mensageiro é formado aqui por exons que o esse verdinho e os intrusos que esse azulzinho aqui mais ou menos e eu processamento geralmente

se dá como atravessa arr o duzentão sim associação dos exons remanescentes e aí você vai ter um rna mensageiro é esse rna mensageiro aqui que vai ser traduzido vai ser utilizado para produzir uma proteína será traduzido em uma proteína e é exatamente isso que acontece o processo de transcrição e claro né se nós temos um são de edson aqui a gente tirou os índios que compunham o rna mensageiro não a duro no final das contas não seremos um sonhos jackson jackson aqui é o final de um ex ou e o começo de outra a mesma

coisa aqui final de um edson começo de outro e aí depois só que não importa muito para gente hoje esse rna mensageiro a gente vai fundo de rna mensageiro ele ali junto com o ribossomo ele vai encontrar os rna transportadores que por conta da sua conformação eles têm exposto três nucleotídeos chamados de cólon o antiquado que também de acordo com a sua formação estão associados a um aminoácido o rna mensageiro junto com rna transportadores ribossomo tem a capacidade de e os esses aminoácidos transportados por os rs transportadoras gerando aí formando uma proteína traduzindo esse código

aqui em algo funcional que é uma proteína isso a parte aqui nem interessa muito hoje o que interessa mais está aqui né aquele primeiro passo lá no processo de transcrição e parte e é um dos mecanismos de regulação da transcrição é o spice ou splicing alternativo eu vou fazer uma pergunta para você isso é que vai ter um delezinho aí né um ver se a gente fala assim que te dar para vocês responderem você já parou para pensar no seguinte no nosso organismo nós temos a maior quantidade de diferentes proteínas ou a quantidade que diferentes

genes não falam de expressão de gênero não de higiene mesmo tem um gênio lá da abert no já pbh tem o sei lá o gênio brca1 e nós temos maior quantidade de diferentes em genes o nosso organismo ou uma quantidade de diferentes proteínas nosso organismo manda aí para mim e eu e a gente vai enquanto isso eu vou ver as e as perguntas que me chegaram aqui vamos ver o caramba tem gente da flórida mariana tá vendo da flora então mariana legal que você se apareceu bem-vinda e o vinicius tá falando aqui de ficar perguntando

de outras metodologias como sagge me salvou só mencionar o site aqui mas eu não vou falar sobre ele mas eu posso falar isso e uma outra aula se for relevante se as pessoas acharem quer que é relevante e o maria inês eu não entendi sua pergunta mesmo de novo depois quando aí de volta para mim e a natália começaram a chegar as respostas aqui nós temos uma quantidade de diferentes proteínas exatamente isso na quantidade de frente proteína porque é diferente proteína porque um gênio um mesmo gene ele pode ser processado quando ele ativado produz o

rna mensageiro transcrito ele pode ser processado diferentes maneiras então por exemplo aqui o mesmo jeito imagine que isso aqui é o mesmo gene esse aqui é o produto é o transcrito ainda não maduro de um determinado gene ele pode sofrer o processamento que eu mostrei para vocês a retirada dos íntrons ea manutenção dos exons mas ele pode sofrer um outro processamento que a retirada por exemplo desses dois litros a retirada de um dos exons e a junção desses dois é que são lá formando um transcrito diferente então o produto de um gene um gênero pode

gerar diferentes produtos esse diferentes produtos eventualmente podem gerar diferentes proteínas então aqui por exemplo tem o transcrito um que é o produto de uma de um spice e o transcrito dois que é o produto de um outros pais se perdem e apesar de eles terem vídeo do mesmo gênero eles têm sequências diferentes no final das contas eles podem gerar proteínas diferentes assim no final das contas seguintes um gene pode gerar mais de uma proteína é isso que são as diferentes isoformas de um modo geral que é o que está sendo mostrado aqui que eles dois

processamento serão proteínas de férias e o pessoal respondeu todo mundo é respondeu proteína muito bom isso aí a gente falou sobre isso né analisar transcriptome então é analisar tudo tudo quanto é transcrito que tá lendo uma célula todo conjunto com a população de transcritos um de uma de uma célula ou de um tecido isso inclui os arranhar seus rms mensageiros pequenos arranhados arranhado não codificantes isso isso incluiu o pode incluir também estruturas transcricionais como sítio de início terminação 5 em três linhas os padrões spice que eu tava mostrando atrás da para codificar também a mudança

do nível de expressão você não só consegue como eu disse antes também né não só ver o que tá conselho mais quantificar também o que tá acontecendo eu imaginei que se você tem duas situações uma amostra tratada um controle você quer saber não só se os genes eles ele se o nível de expressão ou se a expressão é diferente entre essas duas condições mas você como é que é quantificar também o nível de expressão fazer uma notificação com uma análise pressão gênica diferencial por exemplo nessas duas situações oi e aí pra gente mencionou isso aqui

rapidinho também como é que a gente consegue fazer análise transcriptômica hoje você consegue vibrar há um bom tempo fazer análise temos que toma por mais para ver só que quando a gente todas as técnicas tem vantagens desvantagens né mas com a gente pensa nas desvantagens específicas do marcar e que talvez seja a técnica aí há mais ou segunda mais utilizada para nós estamos clipe toma o marcou ele tem algumas alguns problemas principalmente comparados com a n a sec primeiro é densidade né densidade significa a quantidade de sondas que você coloca consegue colocar no espaço físico

é limitado existe o espaço físico que limita a quantidade de sonda e um chip por exemplo de uma cor e tamanho do edson também ex muito grande talvez sejam difíceis de analisar e a sequência da sonda porque a sonda é você precisa desenhar mas se você construiu um óleo nutritivo que vai ficar preso lá no mar corrico é a sonda essa sequência da sonda não ser a mente ela é específica ao seu ao caso o seu alvo por exemplo tenha sofrido alguma variação a mutação ou uma variação que ainda não é conhecida porta indenização cruzada

você tem uma sombra uma região específica do michael e quer para detectar um determinado o transcrito e vai detectar um outro porque fez uma organização não especifica você talvez tem dificuldade para detectar a presença de transcritos raros porque o limite de detecção a sensibilidade de detecção do mar correia mais limitado e do rna seq por ser feito por ngs você consegue controlar a sensibilidade aumentando ou diminuindo a cobertura você consegue aumentar a sensibilidade e necessariamente quando você trabalha com macau e se ele trabalhar com genes conhecidos por que a lâmina ela feita né o o

chip do michael ele é feito a partir de sondas de dna o pagamente conhecido rn amplamente conhecido existem outras técnicas como acho que foi vinícius né comentou com mps sos age kg em peixe é p m g essas técnicas todas elas são utilizações para nós temos que estão são bem menos eu acredito em principalmente depois rna-seq mas são técnicos disponíveis também e aí tem o sequenciamento dna e o sequenciamento dna por rn a série que nos permitiu altíssima produtividade porque como essas técnicas elas podem gerar dependendo do equipamento que você tem aí você pode tirar

uma grande uma quantidade gigantesca de dados eventualmente é possível começar e terminar um experimento em uma única corrida eu mesmo meus primos outro lado eu fiz aí nessa que doutorado eu precisei de cinco corridas para fazer e eu não precisei de muitas corridas então você executa o experimento uma maneira muito rápida pelo menos a parte de sequencialmente se ela ela pode ser muito rápido o que também nos permite o custo por dados gerados o custo total do rs que ele não é barato e ainda não é uma técnica barato de se fazer mas o custo

por data point ou por transcrito analisado por generalizar vamos mesmo por amostra analisada ela acaba reduzindo é como eu falei da outra vez é como você aí numa na loja da hering no shopping e compra uma camiseta você vai pagar x por aquela camiseta mas se você sei lá fundo distribuidor da hering você vai comprar aquele um grande volume e o curso de uma camiseta para você vai ser bem menor o custo total você maior que vai comprar um monte de camiseta mas o preço que o camiseta esse vai ser menor é mais ou menos

a ideia mais ou menos a mesma aqui e aí a maneira como se constrói como se manipula o rh com você prepara essa mostra que a comissão de biblioteca nos traz aqui algumas vantagens os diferenciais a técnica de arranha-céus que eu vou comentar com vocês que isso que é interessantíssimo já estão correndo sério eu falei gente vai conseguir fazer a purificação da expressão gênica fazer uma análise expressão gênica diferencial também é possível descobrir coisas novas genes novos transcritos novos processamentos diferentes variantes que não eram conhecidos por quê porque é uma técnica de sequenciamento você vai

ler a molécula de dna cdn a no caso né não é real lá na molécula original você vai ler a sequência da molécula e a partir de uma leitura você pode descobrir aliás é possível fazer uma rna seq é eu vou falar aqui na frente que o nessa que devo então você consegue descobrir também analisar os diferentes padrões dos plays em e descobrir diferentes padrões dos pais que até então não eram conhecidos dá para fazer variação estrutural como análise como junção de diferentes transcritos fusão gênica e consegue fazer na difusão gênica por exemplo que é

denovo cê tá sequenciando cidade descobrindo a sequência na ordem que ela está na vida real dá para fazer um monte de análise de a pós pós sequenciamento posso posição e ginástica como análise de ontologia ea análise via metabólica e da fazer o transcriptoma de novo também que é você sequenciar um transcriptoma pela primeira vez ainda que não exista ou exista limitadamente um genoma como referência e aí olha só essa analogia aqui eu eu tenho essa imagem que eu vou mostrar para vocês já faz um bom tempo eu perdi a referência dela se alguém souber a

referência das imagem aqui me avisa porque eu quero colocar referência porque é sacanagem mostrar essa aqui sem referência porque é uma analogia ela é fantástica olha só fazendo ali transcrições correrias aqui é a mesma coisa que você numa uma banca trabalhando numa banca e você não vai comprar uma revista ou duas revistas que a gente faz normalmente não vai no banco você vai chegar para o dono da band faz o seguinte amigo eu quero todas as revistas da sua mãe todas eu quero todas eu não quero que nenhuma é para trás me dá tudo que

você tem aí o dono da banca facial por ela você vai acabar com meu estoque aqui até te dou todas as revistas mas ó tá no composição como punição já que você vai pegar tudo eu vou te entregar eu até faço um preço mais barato para você só que eu vou picotar todas as revistas antes de te dar eu vou passar isso aqui naquele picotador de papel a picota tudo e agora sim você pode comprar todo todo o meu estoque aqui e você leva isso aí para casa e aí você se vira para conseguir essas

revistas cara fala tá bom beleza é justo já que eu vou comprar a revista todas as revistas acabar com o estoque ainda pagar mais barato e dá tudo aí picotado mesmo porque eu vou chegar lá na minha empresa na minha casa vou juntar um monte de estagiário eu vou fazer essa galera toda juntar pedacinho por pedacinho da revista até que eu consiga ela na íntegra depois quando você faz uma análise de rna seq é uma análise feita a partir de emergência em sequenciamento de nova geração você vai fazer mais ou menos isso ou quase isso

daqui com o seu transcriptoma você vai chegar em uma célula no tecido e pegar o transcriptoma vai pegar tudo quanto é transcrito que tem ali coisa que se conhece coisa que não se conhece e feliz precisamos vai pegar tudo só que infelizmente não é possível você pegar um gene em táxi do jeito que ele tá se ela no tecido de sequenciar você descobrir a sequência dele bonitinho o integral de ponta a ponta todos os milhares de fragmentos ou milhares de bases para as bases de um gênio você não vai ouvir o que eu tinha de

um transcrito você não vai conseguir sequenciar isso na íntegra você precisa necessariamente pegar esse fragmento grandão pico tyler fragmentar a gente algumas manias de fazer se você transforma você gera fragmentos pequenos e aí depende da tecnologia de 150 250 pares de bases isso vai gerar esses fragmentos os pequenininhos e aí sim esses fragmentos pequenininhos você consegue sequenciar aí sim você consegue pegar a sua mostra de assinar agora picotada fragmentada e colocar um equipamento de sequenciamento de nova geração e sequenciar só que depois que você faz isso que você vai misturar um doce mundi rn aquele

monte de fragmento ali milhões e milhões e milhões de fragmentos todos juntos na reação de sequenciamento alguém algum momento e no caso e geralmente alguém formata ele vai pegar todos esses fragmentos e começar a alinhá-los colocarmos o certinho depois colocar nas coisas certinhas ele vai remontar para você o transcriptoma então ele vai primeiro alinhar colocar todos as fitinhas ali da revista na ordem certa e depois juntar colar sua revista com durex sei lá que ele vai fazer mas ele vai montar isso para que você consiga a revista para que você consiga fazer análise no seu

transcriptoma e interpretar a informação biológica que você tinha lá na sua célula e é isso que a gente vai fazer a gente vai seguir com essa analogia aqui ao longo da análise ao longo de todo o fluxo de trabalho e esse aqui é o fruto de trabalho que a gente vai seguir olha só então a gente a primeira isso aqui é o é como se faz meses lá na vida real se você for utilizar ou quem já utiliza vai fazer vai seguir essa essa aí essa linha aqui lá na bancada a primeira coisa largamente a

você obter seu rna depois de extrair e purificar o seu rna e aqui tem um talvez uma pequena diferença do que a gente faz com outras técnicas que é o processo de enriquecimento que eu vou falar para vocês depois a gente vai para a biblioteca é aqui nesse momento a gente vai picotar os fragmentar todo rna para poder analisar para adicionar adaptador eu vou falar tudo sobre isso aqui daqui a pouco para vocês e aí vai amplificar e sequenciar ea gerar o resultado bruto nos seus dados brutos e depois analisar os dados que fazer a

minha mente a montagem a quantificação lá na nossa analogia esse primeiro passo aqui a extração do rna você chegando lá na banca você chegou na banca e falou para o cara quero eu quero tudo que você tem é que a extração de rna você pegou tudo que tá disponível ali depois o cara vai falar assim para você lá na banca eu te vendo mas eu vou fragmentar para você vou te contar tudo que a gente vai fazer lá na construção de meu teka depois você leva aquela revista toda picotada para casa que é uma amplificação

e o sequenciamento e aí por fim seus estagiários vão lá e vão juntar todas as revistas que é o que vai fazer talvez unb o formato ou você vê se você souber trabalhar com essas ferramentas você mesmo pode fazer análise dos dados mas já vou falando em geral não é halo trial vamos subir com esse com essa linha aqui eu vou começar então com a extração de rna g1 a extração de rna olha o começo o processamento da aqui ele não muda se você já manipula remédio e não vai ser muito diferente se você trabalha

hoje a para sei lá para ver se a em tempo real se você fez alguma outra técnica mesmo acabei aqui a manipulação vai mudar muito que você tá trabalhando com r a que é uma molécula passível muito mais fácil de degradação que é o dna então você tem que tomar muito cuidado para evitar que a sua mostra de rna ela sofra a atividade de quem dança rn assú rn ases são essas enzimas que catalisam a degradação do rna que estão presentes no meio tá presente na bancada da presidente na luva está presente na saliva o

suor onde você colocar a mão onde alguém colocar a mão empresa na caixinha que você guarda sua mostra que está presente em todo lugar e além disso existem as rédeas da própria nossa porque os tecidos os organismos produzem a realize é um mecanismo de proteção então quando você manipula se você não tony por um tecido uma amostra para a extração para analisar você tem que tomar cuidado para que essas rn ases presentes no meio e presente nas suas amostras elas não sejam ativados inativar os alguma maneira você pode na tivesse por temperatura ou com produto

ou processar nessas amostra imediatamente mas hoje não vem ao caso falar sobre isso aliás assim como ter uma aula de de sequenciamento de nova geração e no carro tem uma aula específica de manipulação de ácidos nucleicos a extração purificação de controle de qualidade de ácido nucleico se você não viu dá uma olhadinha é tão sempre quando você trabalha com a melhor coisa é prevenir os a luva trocar de luvas em que possível não encostar na cara os a máscara se você tinha falado no processo isso tudo que a gente vai entrar em detalhes agora e

também trabalhar com agentes que inibem atividades reais como dietilpirocarbonato ou albergue que você trabalha com água tratada com isso é incubada ou uma concentração de 01 por cento de dietilpirocarbonato que esse produto é que invita a atividade das rms e lógico tem que fazer isso com muita rapidez tomar cuidado para você não degradar sua morte de jeito nenhum armazenar do jeito certo etc isso para mim independente que você vai trabalhar pode ser o swab bucal pode ser tecido pode ser folha pode ser célula pode ser bactéria pode ser sangue e isso dá igual para todos

para todas essas amostras você tem que tomar esses cuidados e armazenamento né vai armazenar e a menos 80 graus ou vai armazenar em nitrogênio líquido que é uma ótima ideia ou vai armazenar uma solução de preservação o que permite que o cenário é você vai armazenar por mais tempo em uma temperatura um pouco mais alta como na geladeira por exemplo menos 20 ou até mesmo temperatura ambiente mas de qualquer maneira esses processos todos aqui tem como objetivo inativar as rn as porque a sua moto não seja degradada ainda que você vai desagradar só nossa daqui

a pouco é um dos primeiros passos justamente a degradar para alimentar sua mostra de rna só que você quer ter o controle do quanto você vai degradar você quer ter o controle do tempo que você vai vai fragmentar na sua mostra e se você tiver ela já de granada aí pode ser um problema vamos lá vez que você coletou você vai ter que extrair purificar de novo a gente não vai falar disso aqui mas aqui tem uma tabela se você quiser dar print ou você quiser pegar a aula lá de extração purificação eu falo sobre

esses métodos aqui e você pode purificar extrair purificar sonhado por qualquer método convencional pode ser com fenol clorofórmio com crise o mesmo que é um dos clássicos né que vai fazer a purificação ali através do final do clorofórmio formando fases diferentes no processo de extração onde você tem o rh na camada superior dessa fase ou colunas de cine calculo.net centrifugação que vai segurar vai reter o seu rn é algo que você consegue desprender depois ou você pode fazer isso por bits magnéticas que é altamente recomendado vai ter um processo aí e separação do seu rna

através da associação delas kombis magnéticas que por sua vez vão ficar presas a um imã e você consegue fazer a purificação e aí aqui tem um tipo de amostra recomendado para cada uma necessito ações mas assistam aula completa lá que eu falo com mais detalhes o pato que nesse processo todo tem uma coisa quando se fala de rma será que que é preciso tomar cuidado que precisa ter uma atenção especial que é o seguinte e qual é o álbum que você quer analisar quando você vai fazer uma laje transcriptoma você de fato quer fazer uma

análise transcriptoma de todos os transcritos presentes na célula ou será que você quer só analisar os transcritos provenientes de rna mensageiro talvez você queira trabalhar só com a minha mensageiro ou não o seu objetivo é trabalhar com o micro-rna então o rna é algo que você vai analisar ele é muito importante aqui porque quando a gente fala de outras técnicas como pcr em tempo real com micael rey em algum momento você vai selecionar o alvo que você vai analisar ou os alvos que você vai analisar seja por pcr ou polinização você seleciona que você quer

analisar aqui talvez não talvez como você vai dar esse tiro de canhão analisar tudo você pode ser começar tudo o que tiver além da célula e isso pode ser um problema e você sabe porque quem sabe porque isso pode ser um problema manda aí para mim que eu quero ver se chegou uma pergunta aqui o eduardo você poder fazer uma aula sobre eletroforese bidimensional de proteína pretende usar essa técnica olha eu não eu a clínica fica essa técnica não dormiu proteína mas eu vou eu vou chamar especialistas de outras técnicas para compor aqui o quadro

de especialistas universo sabe o mal isso não vai acontecer agora mas vai acontecer algum momento tá então o eduardo vai ter conteúdo muito provavelmente sobre proteína num futuro breve aí tá mas eu não eu não tenho capacidade agora de dar uma aula pelo menos uma aula com conteúdo profundo eu consigo de aula de maneira superficial até consigo mais profundamente eu preciso de um especialista e eu já estou trabalhando isso em breve a gente eu falo sobre isso com vocês e vamos ver se alguém respondeu a pergunta aí qual que seria o problema de vocês e

conhecer a tudo quanto é rna quando você faz um rna-seq tem um problema porque é qual é a população da real o tipo de arranhar mais presente numa mostra no tecido numa célula é o rna ribossomal rna ribossomal rna se que bolsonaro eles representam eu não sei por volta de 80 85 porcento da população de transcritos de uma célula então quando você vai extrair quando você extrai aí na total você extrai muito rna ribossomal rna ribossomal nem sempre o que você quer ver provavelmente não é o que você quer ver porque ele talvez você já

tô informativo sim talvez seja mais nessa mensageiros migraneas alguns outros não codificantes mas não é re bolsonarl tô como se trabalha com é análise de rna total total mesmo os rns reembolso mais podem ser um problema se você não quiser analisar os rms bolsa mais que é o que acontece na maioria dos casos e sem problema então é esse processo de seleção enriquecimento do crm alvo é fundamental aqui na re na sec oi e aí você pode de fato fazer uma nagma total mesmo se você quiser mesmo analisar os carrinhos e bolsonaro assim por diante

você pode extrair e purificar rna mensageiro existem kits eu tô mostrando só um pouquinho eu vou mostrar de outras marcas bem mas aqui só para você saber que existem kits que conseguem selecionar no processo de purificação você parte de uma mostra a renda total e seleciona rna mensageiro aquele funciona nesse caso aqui consumidos magnéticas são vídeos magnéticas que associado a sua superfície tem uma calda de polly ter mas tem um óleo nucleotídeo ali como se fosse um primer todas de timina o boa parte delas determina que a justamente compatível com quem complementar a quem a

calda de poleadas rn as mensageiras então você consegue capturar somente os rm as mensageiros rn as mensagens que tem cauda de policiar e associar isso abre de magnética abd magnética fica presa no e você retira todo o resto que não te interessa um r bolsa o e outros contaminantes também na sua mostra então você consegue sair o problema de um kit com esse aqui um você vai trabalhar só com o mensageiro ele só vai capturar em um mensageiro em só em um mensageiro que tem cauda de olhar e nem porque nem todos têm né você

tem a opção de trabalhar com kits de extração só de me conhece e se fosse objetivo aí você vai trabalhar só com micro real ou você pode partir de rna total e depletar removê-los a renascer bolsonaro existem kits que fazem isso que você tem ali sua renda total eo rna total é tudo mensageiro de bolsa mal transportadora tem tudo ali existem kits que retiram somente os que bolsa mais que a depressão dr bolsonarl que eu mostro aqui rapidamente porque é um processo parecido com a purificação por mídia magnética né você vai ter ali na sua

mostra aqui tá a molécula de dna mas é hinata é mais fácil de charme à mais fácil visualizar também então você vai ter ali a morte de renato total aqui tem tudo que te interessa e tudo que não te interessa que se a bolsa mais e associadas famosa você mistura aqui nessa mostra um óleo nucleotídeo como se fosse um trailerzinho mesmo que ele é é complementar especificamente complementar a sequência do rna ribossomal então essas ondas em esse oligonucleotide assim como o crime ele vai se ligar especificamente só que ele vai ser especificamente a rna ribossomal

nada mais e essas onda esse olho nucleotídeo como se fosse um painelzinho ele está associado a uma molécula e essa molécula ela pode ser associado a uma mídia magnética que tu se faz um sanduichinho você coloca você tem o seu rna ribossomal que você não tinha que não te interessa você associe-se a reembolsam álcool umas ondas vão se ligar formatura de dna dupla fita ali essa sonda você consegue prender um abrir de magnética e essa medida de magnésio que você pode utilizar para filtrar aqui todo o processo tá olha só aqui nessa nesse no exemplo

eu prendi nabi de magnética os rna é um preso a sonda que por sua vez estão querendo saber de magnética aí eu coloco essas vídeos magnéticas perto de um imã e prendo essas bolinhas com zé renato e bolsa mais de cima aí eu tiro daqui desse tubo todo o resto que são os reais que me interessam então eu depositei eu removi os rns que bolsonaro da minha análise aí eu consigo purificar ressuspender concentrar esses rs que sobraram que é o que me interessa que eu tenho que analisar depois pode pode fazer por etanol como acontece

na maioria dos casos pode ser também por coluninha ensine que você consegue aí eu passo o final lá da emissão concentração e lição de purificação de rna ah ah mas para isso você precisa de um irmãozinho aqui só para quem nunca viu isso aqui esse processo né esses tem umas colônias aqui que são mínimas então essas vídeos essas bolinhas aqui preta são umas bolinhas minúsculos assim elas elas são atraídas pelo imã e ela fica presa mesmo mínimo você consegue separar o que te interessa do que não te interessa e seguimos aqui consulta o trabalho então

a primeira coisa a gente chegou lá na banca de jornal de revista e falou eu quero todas as revistas eu quero faltar bom então só que eu vou picotar essa revista para você assistir vender e aí entramos na construção da biblioteca o que é o primeiro passo lá da do fluxo de trabalho de do rgs e aqui no caso da renascer que você vai ter quatro objetivos principais o primeiro objetivo como eu disse para vocês a geral fragmento do tamanho adequado no tamanho do fragmento que é compatível com a tecnologia depois a gente vai utilizar

técnicas para manter a orientação da transcrição a informação da orientação da transmissão olha que isso aqui é fantástico por tá bom já falado isso daqui a pouco aí depois a gente vai adicionar os adaptadores que têm diferentes funções aí no meio do processo e adicionar marcadores de amostra pra gente fazer multiplex sequência mais de uma amostra por vez só e onde é que o primeiro objetivo que é gerar frio em tamanho do tamanho adequado você vai pegar sua renda total ou rna depletado rna algo que você selecionou e você vai falar inventar isso você pode

fragmentar com enzima pode ser uma rs3 por exemplo é realiza mesmo você consegue comprar isso vem aqui se você compra e fragmento ou fragmentos de maneira mecânica com sonicação por exemplo de qualquer maneira que você vai fazer pegar que eu tô mostrando meus rs totais que eu tô mostrando em três cores aqui mas o meu renato total tanto eu sei lá o jenny oh jenny azul vermelho eo verde e você vai pegar essa mostra de rna por um desses métodos e não importa como agora e vai gerar fragmentos do tamanho que te interessa no caso

de um processo de fragmentação tanto de enzima como mecânico quanto maior a intensidade é o maior o tempo que você submete a sua mostra esses processos de fragmentação menor é o fragmento então você consegue selecionar nesse processo fragmentos mais ou menos se você precisa se você precisa de fazer a mente 250 pares de base por exemplo você atravessa a quantidade de rna que você tem ali na mostra mas o tempo que você mantém aquela mostra encubada coenzima de digestão a enzima que vai digerir o seu rna consegue selecionar mais ou menos vai selecionar exatamente não

invadir a sua fragmento totalmente interessa mas vai tirar muito dos fragmentos ali totalmente interessa só que para você saber que esse processo aqui funcionou geralmente deixa eu só fazer um dos câmera que eu esqueci de avisar eu tô mostrando um método de construção de biblioteca tá não existe só esse aqui não eles vão seguir o raciocínio semelhante a esse mas existem variações aqui desse processo mas aqui importa vocês entenderam o conceito geral da coisa bom é você precisa saber que esse processo de fragmentação funcionou do jeito que você gostaria e você tem pontos de controle

de qualidade ao longo desse processo todo e é fundamental porque você não quer seguir com uma técnica uma técnica absurdamente cara e trabalhosa oi gente com fragmento ruim né com a biblioteca mal fragmentada só você tem pontos controle de qualidade tem que fazer quantificação que é recomendado fazer por flor ametria e você tem que ver a distribuição dos fragmentos qual o resultado da sua fragmentação você faz isso por uma eletroforese capilar' o bioanalyzer né aí você tem um resultado como esse aqui então esse é o perfil de uma fragmentação de rna mensageiro pois então se

você começou a remar mensageiro fez a fragmentação vai ver mais ou menos isso aqui para quem não sabe que eu tô mostrando aqui isso aqui é como se fosse uma ela é como se fosse um só que é um eletroforese só que ela não acontece um jorge agarose ela acontece um capilar e esse capilar em vez de você vê a banda né você vê aí se capilar esse equipamento aqui ele tem a capacidade de ler a fluorescência da banda né da mostra só mostra impregnada com a florescência ele dá um pico que foi assim se

fosse um gel seria um gel correndo daqui para cá você colocou as amostras aqui na nas canaletas aqui em cima nós lá em cima ligou eletroforese ele está migrando daqui para cá isso aqui seria como se fosse a banda então os fragmentos menores estão aqui e os maiores estão aqui então essa esse meu esse meu resultado aqui é da fragmentação tá ali por volta dos dentes podem de base mais ou menos que hora que precisa isso e como se trabalha com a henna mensageiro se for aí na e bolsonaro depletado o nosso de renato total

sem e bolsonarl ficam um perfil mais bonitinho para se ver aqui né bico mais mas é definido se tivesse assim que eu chegar algumas perguntas aqui obrigado você eduardo com a música depois do para fazer a depressão se utiliza um kit para extração de rna total e depois ou truques para depressão exatamente isso mônica eu não deixei claro primeiro você está em na total porém fica tá prontinha para você seguir só que antes você repleta rir bolsonarl é isso aí então extrair primeiro purifica primeiro depois depilada ribossomal oi e o kit de faz a depressão

específico tá ele específico porque se uma outra coisa que eu não falei né eu falei para vocês que a e isso é muito importante eu falei para vocês que o rna ribossomal ele é selecionado através de uma sonda que é complementar à a sequência do rna ribossomal né e essa sonda portanto ela espécie-específica você compra um kit ou cê compra um kit de depressão dr rey bolsonaro de espécies específico só vai ter um kit pra de completar rna ribossomal de um ano de camundongo de rato de planta de bactéria tudo isso cada kit vai decretar

11 um uns rna ribossomal específico de cada espécie tem suas sequências né então nem toda a sonda complementar de fato uma r bolsonaro tá então é isso aí ó é a técnica de rna seq pode ser usado em proteômica não diretamente assim não pelo menos talvez alguma variação mas não diretamente como eu tô mostrando eduardo então segui aqui o outro objetivo é a manutenção da informação da orientação né da transcrição quem só que olha só quando você tem quando um gênio é ativado e vai ser produzido a partir de ali um transcrito né vai ser

uma reunião vai ser gerado vai ser produzido no processo de ativação de expressão de um gene esse transcrito ele pode ser gerado a partir de uma das fitas do rna porque o rna uma das fitas do dna porque o dele é dupla fita né eu ia ter uma fita a gente chama de sense ou de ou positiva ou a outra fita fita complementar ea antisense é uma negativa de qualquer maneira url vai ser transcrito e vai ser produzida a partir de uma das fitas tá não é sempre do mesmo lado ele a partir pode ser

ele pode ser gerado a partir do da fita sense como a sense do dna e essa informação muitas vezes é importante você manter essa informação você saber se aquele transcrito livre da fita ciência ou da fita decência pode ser interessante para uma análise existe um passo aqui no processo de condução biblioteca que você faz que é justamente para você manter essa informação tá eu que eu tô mostrando agora que é uma ligação a primeira rodada de ligação de adaptadores é para você fazer a manutenção da orientação da transcrição e nesse caso eu tô mostrando aqui

então aqui tá o nosso reunião alvo é isso que a gente quer sequenciar né tomar a gente que nós temos milhões e milhões nesse fragmento aqui quem tá sequenciando ou fragmentos de rna aqui tá se conhecendo é que eu tô mostrando um só então a gente não sabe a sequência tá aqui é o que a gente quer descobrir mas a gente utiliza nessa reação nessa rodada de ligação com adaptadores é esses adaptadores aqui ó de fita dupla não é um danielzinho fita dupla ou rna nós também ar ele é e lembre-se dna ou rna mas

de qualquer maneira ele é feita a dupla essa sequência que vocês estão vendo aqui ela é conhecida ela foi produzida artificialmente a gente conhece sequência essa sequência que ela também ela a gente conhece que que ela foi produzida para isso só que essa sequência esse rabinho que essas esses dois adaptadores tem são sequências aleatórias de nucleotídeo ou seja esse rabicó aqui ele pode ligar em qualquer e na tão e como você tem uma quantidade imensa desses adaptadores e cada um desses adaptadores vai ter uma sequência diferente dessa que eu tô mostrando aqui com ele eles

vão se ligar ao longo de toda a população de arranhar que você tem na sua mostra de maneira inespecífica mesmo ele liga que ele faz essa ligação e aí você tem essa estrutura e quando você tem essa estrutura que fez a hibridização aconteça com g você fez essa ligação assim como um primer se liga você mantém a informação da direção da transcrição agora com isso não importa o que você faça oi e a gente vai fazer pcr mais de uma vez vai amplificar isso mais de uma vez vai manipular essa moça de várias vezes mas

a partir de agora você não perde mais informação da direção da transcrição isso vai ser armazenado outro primeiro passo essa esse passo de mobilização que acontece de maneira aqui ela é específica né mas os nucleotídeos aqui não são específicos eles são é degenerado sou são inespecíficos no pretensão aleatories e aí depois você faz uma ligação zinho aqui com a ligasse mesmo só para juntar essa fitinha de dna de ganhar com essa daqui né você precisa fazer essa ligação e a partir daí você consegue agora como você tem que terminar desconhecidos fazer uma transcrição reversa e

produzir uma molécula de dna complementar faz a tração reversa também a cumprimentar agora você tá a pena fazer o quê pcr e não só isso né agora aí você estará apto a fazer percebe porque se eu errei me agora foi utilizado para sintetizar normal quando você ganhar você tem extremidades conhecidas e agora você consegue manipular esses com tranquilidade oi e aí vem a segunda rodada de ligação de adaptador dia dicionário adaptador que é feita através de uma de uma alguns ciclos alguns poucos ciclos de pcr tão que tá o seu ao com ciúme da desconhecidos

é uma fita só o primeiro ciclo da pcr você vai utilizar um primer que se liga a esse fragmento que você adicionou hotel artificialmente e o seu primo ele não está sozinho não seu primo está ligado a um outro adaptador que eu tô mostrando aqui de laranja e amarela e aí a primeiro passo da pessoa aí vai acontecer formoso fritar dupla o segundo passo da pessoa aí vai acontecer aquele primo e se liga nessa extremidade um outro primer o paneforte vai ser enganar o senhor idade ele também tem um rabicó que ele também tem um

adaptador e aí você segue fazendo a pcr entre ficando e no final das contas você vai ter várias cópias do seu fragmento alvo com esses adaptadores intermediários que mantém a informação do direcionamento da transcrição e os outros adaptadores que eu tô o jair b que tem algumas funções inclusive fazer amplificação e eu fazer o processo de sequenciamento e assim por diante é bom e aí você tem um passo aqui que é opcional que o quarto passo que adicionar marcador na mostra porque você pode fazer sequenciar mais de uma mostra por vez você pode ser conhecer

aí sei lá dezenas de amostras em uma mesma corrida dá para misturar tudo e sequenciar tudo junto para isso que você é a única coisa que você vai ter que fazer é utilizar um adaptador específico para cada mostra então aquele adaptador que eu chamei de água adaptador db eles são iguais para todas as amostras com exceção de um pedacinho que eu tô mostrando aqui de preto então se eu tivesse se conhecendo três amostras por exemplos a minha mostra arterial adaptador ao adaptador b só que lá na adaptador ar ela vai ter um pedacinho extra de

nucleotídeos aqui que é exclusivo do adaptador que usei na amostra a amostra b vai ter exatamente os mesmos adaptadores só que uma pequena modificação de nucleotídeos aqui que é o roxo meu caso representando como roxo e só as amostras da só as nossas b tem o adaptador bom e depois a mesma coisa com amostras e só as amostras e tem o adaptador é amarelo então são fragment in his pequenininho sequência os pequenininhos de dna aqui que são exclusivas de cada mostra que você consegue comprar isso e fazer esse processo aqui lá na consumir o meu

teca e aí depois que você construiu a a biblioteca da amostra a separadamente da amostra b separadamente na nossa separadamente cada uma com um marcador específico você pode juntar isso aqui tudo numa reação só isso é conhecer a porque lá no processo de sequenciamento uma das primeiras coisas que é sequenciada é justamente esse fragment em colorido aqui os fragmentos que é que marcam a amostra né que identificam amostra e o algoritmo o software lá do processo do sequenciador ele falou a aqui foi um fragmento preto fragmento preto é mostrar aqui que você conhecer foi um

fragmento rosto aumenta o rosto amostra b e assim por diante aí na análise dos dados eles e para isso tudo de novo e faz sequenciamento foi todo junto a tela toda separada tá com sono de biblioteca separada você conhecimento junto e análise é separada ah beleza então agora a gente picotou nossa revista vamos levar para casa se monte de fragmento picotado que é o processo de sequenciamento de amplificação e sequenciamento aqui eu tô falando amplificação porque essas técnicas aos sequestradores que utiliza hoje energia é essa é a maior parte pelo menos eles demandam que você

amplifique todo aquele seu alvo toda aquela sua biblioteca para você conseguir gerar um sinal no processo de sequenciamento e aí sim sequenciar eu tenho um passo intermediário aqui entre a construção de biblioteca e o sequenciamento que a magnificação é uma pcr não é uma pcr convencional não mas não deixa de ser uma pcr tá e aí você se conhecia e vai gerar muitos e muitos e muitos dados todos ao mesmo tempo e agora você tem que pegar aquele monte de revista picotada e remontar juntar todos os pedacinhos de novo que é o que a gente

faz análise dos dados a análise dos dados gente vai seguir aqui um dia formato o quem for fazer as análises vai seguir mais ou menos essa essa hora não exatamente essa ordem nós vai seguir assim essa linha de raciocínio e que a gente fala em informática seguia um pai qe line de análise que é mais ou menos aqui tô mostrando primeira coisa é como eu falei para vocês alinhar pegar toda aqueles fragment in us ali e alinhar todos de volta os pedacinhos de revista para depois você poder montar a revista aí depois você vai quantificar

e voltando aqui para expressão gente vai quantificar na expressão gênica vai fazer na expressão gênica diferencial fazer análise funcional detectar variante tudo se consegue fazer ou entender um pouquinho sobre acho que os principais aqui esses três aqui são os principais aos mais complexos e diferentes que alinhamento montagem quantificação como se funcionam ou essa alinhamento então a primeira coisa a gente de um monte não quando a gente faz as minhas é que recebeu o resultado da renascer que você não vai montar aquele seus fragmentos no escuro quando utilizar uma a mão tá aqui se você tiver

trabalhando com humano por exemplo você fez uma análise transcriptoma de humano você já tem uma informação valiosa para te ajudar que é a sequência no genoma humano já foi sequenciado várias vezes tem diferentes versões e conduzir então você tem a sequência do genoma humano para te auxiliar nesse processo de alinhamento é mais ou menos como esses malucos da serviços ele já tivesse outras edições aquela revista na casa dele aí os estagiários que estão lá montando os pedacinhos a revista eles podem utilizar as revistas as edições antigas como referência todo o processo dele vai ser facilitado

quando você tem uma referência uma outra analogia aqui que fica até mais fácil entender imagine você com aquele quebra quebra-cabeça gigantesco de milhares e peça uma coisa é você montar um quebra-cabeça sem saber a imagem que vai ser gerada né quando você juntar as peças do jeito correto a outra coisa você tem aquela imagem na caixa do quebra-cabeça que geralmente acontece né o bico junto aquelas pecinhas com muito mais facilidade é que a mesma coisa se você tem uma referência onde você faz uma hashtag você tem um genoma que já foi sequenciado isso te auxiliar

de mais um processo de alinhamento e montagem dá para fazer sem uma referência dá para fazer mas é absurdamente complexo mas dá para fazer mas geralmente utiliza uma referência ou pelo menos parte de uma referência só que tem um negócio você tá utilizando um genoma como referência utilizando a sequência de dna de um organismo e não sequência de rna que não tava te dizendo sequência de transcritos eu tava te dizendo a sequência dna isso vai dificultar um pouco processo que vocês vão ver já já tá bom então tá aqui ó seu cada linha cada linhazinha

vermelha dessa daqui é um fragmento que você gerou lá na fragmentação na construção de biblioteca que você sequenciou e virou dados para você então cada um que você vai receber como resultado é o sequência de vários fragmentos da sua biblioteca que isso também é chamado de rede tem um fragmento o vídeo geralmente o produto do sequenciamento né o resultado do sequenciamento e aí um algoritmo bem formata o quando você faz uma análise você pega esse fragmento aqui e você compara com o oginal de referência você vai alinhar aconteça com g ou fazer a comparação da

sequência mesmo contra aonde aquele fragmentos eles anela por exemplo seria um esse fragmento aquele poderia ser alinhado ser proveniente do gene geap dh ele é um gênio do japa da gaita um lá no processo de alinhamento você vai pegar esse fragment nho a esse fragmento olharem ou no cromossomo 3 lá no nucleotídeo 2427 é isso que ele vai fazer postar diariamente é isso que ele vai fazer é como sei lá lá no cara montão na revista hora que ele está refazendo a revista ele acha hoje fragment in aqui eu olhei nas edições passadas que o

cara já tinha aí nas revistas que já tinha como referência e esse fragmento aqui é da revista veja na edição de abril na página o que está fazendo é mais ou menos isso não você vai conseguindo alinhar esse fragmento e aí ó fazendo o alinhamento você vai juntando um pedaço com outro né se a gente pegar esse pedaço aqui e usar informação dos pedaços mais informação desse pedaço mais desse mas desse mais eles no final das contas gente tem o fragmento inteiro aqui né a sequência toda do fragmento do transcrito do gene e etc mas

como eu falei para vocês tem uma dificuldade aqui porque nós estamos fazendo um alinhamento o processo de alinhamento é feito com outro um genoma e o genoma é a sequência do dna portanto nós temos a informação do intro e dos exons 10 e a nossa mostra ela veio disso daqui de uma reunião por isso foi um rna mensageiro né ela veio a partir do produto a gente se conhece ou fragmentos que vieram deste reinar mensageiro aqui e o que pode acontecer é que o vídeo o resultado do sequenciamento ele está justamente olha que desgraça justamente

em uma junção edson edson edson se você conheceu o pedaço de um transcrito que é uma reunião mensageiro processado que já sofreu spice e esse vídeo lá no processo de fragmentação ele caiu justamente entre uma junção a questão é que se você tem um então aqui no meio do caminho então o algoritmo de alinhamento ele tem que considerar quando ele faz a análise quando ele vai fazer o alinhamento desse vídeo aqui desse fragmento sequenciado ele tem que considerar que eventualmente existiram íntrons aí no meio do caminho dele e os algoritmos eles consideram isso mas a

dificuldade a mais no processo de sequenciamento de análise dos dados e olha só outras coisas que podem acontecer no processo de alinhamento esse fragmento aqui ele foi sequenciado e era um processo de alinhamento não encontrou nenhuma região complementar de um fragmento que você conhece ou não gerou nenhum dado ele não há nenhum lugar daqui do genoma isso pode muito provavelmente é um erro algum e correu ao longo da especiais esse manipulação não é a gente não pode descartar a possibilidade daquele fragmento que você se conheceu ser algo que ninguém se conheceu antes um pedaço de

genoma que ainda não era conhecido pode ser algo desse tipo principalmente se for um genoma de um organismo menos estudado isso pode acontecer então nesse processo de alinhamento é o primeiro passo aí para você possivelmente descobrir nossos genes então é assim através desse tipo de análise de resultado que você consegue descobrir novos genes com hérnias aqui né eu coloquei novo gênio entre aspas aí porque na maioria das vezes que eu isso acontece é eu mas tem a chance de acontecer descornar g inclusive até pouco tempo atrás estavam descobrindo coisas novas genes novos e humanos um

ano que é o buggane os mais estudados mas sequenciado que existe ainda até pouco tempo atrás vamos escolher um gênio assim de produzir aí na se não codificantes tal não era nenhum que produzir a proteína faz qualquer maneira estavam descobrindo coisas e aí o que mais e aí o que pode acontecer também é esse seu fragment nho ele alinhar não então aí como que ele alinhou não entram se o enterro ele é processado ele é retirado no processo de splicing então pode ser que aquilo que você esteja detectando próxima contaminação por desenhar não pode descartar

essa possibilidade mas pode ser também a possibilidade de você ter uns play sem alternativa a lei que re teve um intro que não é impossível acontecer ou um transcrito que ninguém anotou não fala anotação de transcrito anotação de variante anotação de frio entre a descoberta ea publicação das desfragmente então pode ser um um novo transcrito ali que não foi anotado ainda então novo transcrito e aí você alinhou tudo agora você tem que remontar aquele transcriptoma né que não basta só alinhar olha só o que que é feito na montagem que é um processo que você

faz depois do alinhamento às vezes ao mesmo software que faz versão softwares diferentes que fazem isso então acho que você tem um gene aqui o gene a ele é composto por esse jackson sem esses e em vermelho e pode ser que esse gene a ele produza um transcrito um que é que a processamento que a junção do edson collection 2 mais pode ser que ser geniale sofro no espaço alternativo que ele já não segundo transcrito que é gerado a partir da junção do exon 1 o edson dois e do exon 3 agora imagine você tem

um vídeo que ele é complementar ao éxon um somente alexon ele caiu aqui dentro do processo de alinhamento ele caiu aqui dentro como é possível saber que esse vídeo aqui ele é proveniente da expressão do transcrito um ou ele é proveniente da expressão do transcrito dois tem eh esse tipo de análise que é feito na montagem algoritmos complexos análises estatísticas extremamente complexo pelo menos complexo para mim eles têm a capacidade de determinar se ou ide que ele é comum a dois transcritos ele é proveniente do transcrito um ou do transcrito dois isso é feito na

mão o gene a dá para descobrir novos trança então tá aqui ó imagine que você é no processo de sequenciamento descobriu que o gene a que foi foi identificada a presença na expressão do transcrito um que é outras que não tinha notado já conhecido sequenciado publicado aí você identificou a presença do trânsito dois também notado sequenciado já tava lá esperado que você receber se o resultado com esse mas você descobre que existe um terceiro transcrito que era a junção do hexa 14 são três que não era nenhuma das opções anteriores esse possivelmente isso pode ser

um transcrito que ainda não era notado uma novo processamento que ainda não tinha sido descoberto uns play sem alternativo que ainda não tinha sido descoberta tão aqui nesse processo é na montagem que você consegue descobrir é novos transcritos novos processament eu ia lá na montagem também e na hora que você tá fazendo análise da montagem que aquela informação da fita sencientes em si a manutenção da do direcionamento da transcrição é mantido tá é lá que eles falam essa fita esse transcrito aqui veio da fritar sem esse outro transcrito em meio a fita licença nesse momento

aqui se eu passar aqui para ver se tem perguntas tem e aí eu posso te falar um pouco mais a nadinha expressão por rt-qpcr comparada aí nessa aqui eu falo no final alisson eu falo da pcr em tempo real contra a n as aqui no final e seguimos quantificação tão além de você detectar a presença desses alvos você consegue pode ficar também eu falei do cômodo quando do quanto do isso a gente consegue dar para quantificar e olha como a quantificação de uma maneira grosseira aqui ela é simples a quantidade de ruídos o seja dos

fragmentos que você sequence of de um determinado gene é de diretamente proporcional ao nível de expressão desse gênero ou seja de um modo geral quanto mais expresso é um gênio maior a quantidade de redes que você vai gerar no processo de conhecimento maior quantidade de fragmentos de daquele gene você vai sequenciar seria mais expresso ele está mais presente na célula você vai ser conhecer a ele mais vezes ou mais o maior quantidade de fragmentos aquele gênesis que você vai fazer então existe aí uma relação direta uma relação direta entre a quantidade de redes sequenciado e

o nível de expressão desse gênio então por exemplo aqui de um ela grosso era eu tô falando aqui que o genial é um dois três paraná 20 redes sequenciadas no processo sequenciamento ele é mais expresso que o gene b que tem nesse lado 10000 de sequencias lógico que não são esses números na vida real tá mas aqui só para você ver que a quantidade de mim se ela direto diretamente proporcional ao nível de pressão do gente então gene a aqui por ter tido marco da de sequencias ele é mais expresso que o gene b porém

dizem duas normalizações importantíssimos para se fazer nesse processo primeiro é uma normalização por tamanho imagine que o genial agora é diferente tá aquele gene a e o gene b ele tem o mesmo nível de pressão a gente que você saiba isso por algo magia na sua cabeça você sabe que o gene a tem o mesmo nível de expressão do gene b naquela cela que você analisou só que o gene a ele é duas vezes maior do que o dobro do tamanho fisicamente maior é um é um gênio de sei lá 2.000 pares de bases e

o gene b é de mil pares de bases e por ele ser maior pelo gênio por causa que o gene a é maior fisicamente uma arco gnbr ele necessariamente eu muito provavelmente vai gerar maior quantidade de ruídos no sequenciamento e se você sem fazer normalização nenhuma contar o hidrogênio a e contas de redes do gnv você fala homogênea é duas vezes mais péssimo gnbr mas não é ele não é dos mais para ser duas vezes maior só ele gerou mais vídeos porque não é grande e o bebê pequeno então existe uma uma normalização que você

precisa fazer na análise de purificação que é por causa do tamanho e uma outra normalização é por rendimento de sequenciamento porque eu falei que essas amostras vão ser sequenciadas juntos mas nada me garante elas podem ser sequenciadas juntos mas nada me garante que o rendimento do sequenciamento da mostra a seja melhor que o da amostra b se você conhecia mais dados e gera mais dados na mostrar e o que nós também pode acontecer isso e vá com é normal acontecer então você pensa assim você tiver comparando o gnx entre duas amostras gnx na mostra a

gerou essa quantidade de willis e o gene x esse mesmo gene na mostra ver tirou essa quantidade de vídeos aqui pô ele gerou maior quantidade de vídeos aqui não porque o gênio era mais expresso na amostra b do que na nossa simplesmente foi que você teve mais dados de sequenciamento sequencialmente funcionou melhor teve mais eficiência para essa nossa tem uma outra normalização que você precisa fazer é pelo rendimento que você conhecimento e agora se você já fez ou já estudou rna-seq você vai ver isso daqui você vai lembrar disso daqui ó que o número de

fragmentos uma piada sim então processo de modificação número de fragmentos uma afiados ele deve ser corrigido pelo tamanho do transcrito e deve ser corrigido pelo o rendimento do sequenciamento para corrigir o tamanho do trânsito faz tamanho do trânsito / 1000 e o rendimento sequenciamento é o número total de fragmentos quando criança / 1 milhão é isso aqui nada mais é que o fpkm se você já viu isso alguma vez na vida e ficou desesperada agora você sabe o que que é o fpkm nada mais é aqui o número de clientes que você se conhece ou

e o que você está codificando corrigido pelo tamanho do transcrito e corrigido pelo o rendimento de sequenciamento é oi e aí você vai para lá antes você pode fazer uma lado expressão gênica diferencial que ia pegar essa quantificação que você fez e simplesmente tentar descobrir se o gene x os genes veio todos os genes que você conheceu ele é mais ou menos expresso significamente mais ou menos expresso na condição um na condição dois na nossa tratada na nossa controle a 5 dias e tem algoritmo softwares que fazem isso para você me especializado específicos para fazer

isso aqui são exemplos de alguns que fazem nada expressão gênica diferencial a análise funcional também é muito interessante tem como você dar um tiro de canhão você analisa uma cacetada de coisa por vez você consegue fazer análise sambas como análise via metabólica over por exemplo cobre a metabólica tá mais ativada em uma determinada situação em relação à outra ou os temos ontológicos então aquele genes que você está analisando estão relacionados a condições específicas da célula por exemplo sei lá crescimento de músculos relação ao hormônio de crescimento alguma coisa desse tipo e por último ver as

variantes né no final das contas você tá sequenciando e se você tá sequenciando você pode irritar e aí estava você pode descobrir o identificar a inserção deleção mutação snip microssatélite fusão gênica tudo que tem variação em relação a sua referência ao genoma que você utiliza como referência você consegue a identificar aqui né isso também pode ser muito importância pode ser você pode utilizar essa informação para várias coisas lá na frente fazer análise de genotipagem por exemplo ele dá para falar um monte de coisa que não cm informações muito úteis e aí ficamos aqui deixa eu

dar uma olhada se não tem uma pergunta e a os oureenses manda um suporte@univox.com.br mao.com por favor deixa eu ver o vinícius normalizar por tpm e não seria melhor uma vez que o tamanho de uma biblioteca ficaria 1 milhão acho que depende o vinícius depende da depende da situação cara né eu para falar a verdade preciso pensar para te responder isso melhor é uma boa pergunta para eu responder lá no nosso quadro de perguntas e respostas vou pegar sua pergunta depois a black 2 estavam também utilizado por ao tm não sei quem é e me

falou que deve ser aqui dois o de 72 também é muito usado para análises pressão acho que usei esse tema seja na atm vermelha utilizei esse eu acho quando eu fiz o meu se eu não me engano ela não tenho certeza mas esse nome não é estranho não e olha só vou passar aqui para que horas são aí deixa eu ver coração eu acho que eu o caramba gente falei demais precisa encerrar isso aqui tinha um terminar aqui então rapidão esse ficou re pergunta para trás vou dar uma olhada aqui e tentar responder ondividual vou

colocar nos nosso quadro de perguntas e respostas tá é um resumo então aqui o arma mais poderosa para a gente ir mais atrás que toma sem dúvida nenhuma é ressaca apesar de você conseguir fazer isso por outros métodos e tecnologias acho que aliás é que até agora imbatível eu tenho que então a gente vê o conjunto de transcritos de uma célula em uma determinada circunstância ea renascer como ela acerta técnica que dá para fazer isso lembra que a preparação da amostra consulta a biblioteca ela é fundamental aqui para você gerar os dados adequados lá na

frente principalmente selecionar o algo que você quer analisar e é bem informática ainda um gargalo porque não é trivial fazer esse tipo de análise da trabalho dá trabalho fazer tudo isso o sol você tem sofre mais simplificado mas é caro e tudo mais mas no final das contas ainda é um gargalo beleza então a gente fica por aqui é muito obrigado para quem hein é que ficou até agora no finalzinho bastante gente gostei de ver brigadão mesmo gente significado véspera de feriado ainda vocês agora vão aí eu sei lá que vocês vão fazer mais juízo

não esquece se conseguir nossas redes sociais porque cada lugar eu falo uma coisa diferente e agora para quem quiser ficar tem alguém me perguntou aqui diferença de falar diferença de ipca em tempo real análise de expressão gênica por pcr em tempo real em relação ao dna seque bom primeiro a primeira diferença é a metodologia em si que tem nada a ver uma coisa com a outra técnica metodologia são completo de completamente diferentes mas eu acho que sim que pode pegar uma diferença maior principal entre elas uma delas é a quantidade de dados gerados né você

vai gerar muito menos dados por é por pensar em tempo real de um modo geral do que faz comparado com a gm a7 e quando você faz pensa em tempo real também você necessariamente tem que tá trabalhando com uma coisas conhecidas né você tem e a pri mas você tem que fazer é todo sua manipulação da mostra a partir de sequências conhecidas se não vai conseguir dizer um primer uma sonda ou fazer uma amplificação adequada se você não tiver sequência adequada que ele alguma muito difícil pelo menos então acho que as duas principais diferenças três

principais a técnica em si que tem nada a ver a segunda diferença é a quantidade de dados gerados buscar muito mais limitado na pcr em tempo real e a terceira aí eu pensei uma outra aqui também interessante dependendo de da qualidade do seu sequenciamento do rna seq você talvez precise validar os seus resultados renaseg por uma outra técnica e uma das técnicas indicadas é pensar em tempo real que tende a ter aí uma não sei não vou falar não dá para falar isso mas é uma uma boa maneira de se validar ou confirmar os seus

resultados da regra segue por pcr em tempo real também é uma é uma boa beleza meus queridos é muito obrigado o pessoal que está me agradecendo aí eu que agradeço vocês oi tatiane você perguntou você ensinar hoje a pbh porque esse gene é usado como controle endócrino porque ele tem dia não variar de o seu nível de expressão tem de ar não variar independente do que você faça no seu experimento mas isso não é uma regra tem que ser testado tá bom o que mais valeu bruno cara obrigado você ter vindo aí e o bruno

é bem formata o dono podia ter dado hospital com ele a bruna e aí então foi a letícia que tinha perguntado lá eu dou já pbh o letícia então já que é da galera utilizado como referência algum controle endógeno justamente com isso né porque ele é um genimo acho que se qualquer função dele exatamente agora mas ele é um gênio que tende a manter o seu nível de expressão constante independente de tratamento de droga independente de condição experimental mas é como eu falei isso não é regra você precisa testar isso não existe uma maneira de

testar numericamente fazer um teste no mercado mente para saber se ele é de fato se inspeção que o nível de expressão dele é de fato constante entre as suas condições experimentais para fazer o teste isso é para pensar em tempo real tá gente se era uma pergunta que você vê temporada é bom gente acho que ficamos por aqui depois eu leio mais perguntas eu vou encerrar a transmissão muito obrigado e juízo aí nesse feriadão não sai de casa tchau