Princípios e aplicações da técnica de microarray

é a técnica que nós vamos falar nesta apresentação é sobre o macroway é os microarranjos de desenhar que a tradução para o português dessa técnica então assim como o sol tão blot uma criei é uma técnica baseada na improvisação de sondas de DNA mas a norma técnica de última geração não é uma técnica que gera muitos dados e bastante utilizado então nessa era que nós estamos que era da genômica para que que serve uma criei o que que é possível analisar né utilizando essa técnica é possível analisar tanto a expressão gênica né então esse daqueles

estudos que avaliam a expressão dos genes quanto estudos que avaliam variabilidade não seja aqueles esnips não sei se vocês se lembram quando há a troca de um nucleotídeo p E aí são chamados então de polimorfismo de troca de nucleotídeos simples e os marcou esse também são conhecidos como chip de DNA Então essa hibridização ela vai ser realizada no chip e devido ao desenvolvimento da tecnologia foi possível cada vez mais e diminuindo as dimensões aí hoje em dia possível dispor milhares de sondas e um pequeno chip de DNA e tal que vocês estão vendo esse chip

ele é um suporte sólido normalmente vidro quartzo onde são colocadas as ondas que vão Então investigar a presença de milhares de sequências que sequência seriam essas sequências que identificam Genes específicos ou sequências que podem diferenciar um Alelo de o outro e um polimorfismo tô mostrando um pouquinho mais para vocês como que que funciona essa colocação de sondas nenhum como que funciona o chip né aqui embaixo a gente teria um esquema de como seria um chip tá aqui a gente tentam uma ampliação desse pequeno quadradinho e aqui dentro desse pequeno quadradinho são vistos os pontos na

então cada ponto desses ele vai ter uma série de sondas tempo para relembrar um pouquinho que quer a sonda mesmo né som dá um pequeno fragmento de DNA fita simples que identifica um gene ou uma variante então em cada um desses pontos vão ser adicionados uns adicionadas sondas né e para cada ponto a gente vai ter a sonda que identificam Gene ou um Alelo então que como vocês podem ver a gente tem e por exemplo nesta posição investigando o gene do receptor de estrógeno nesta outra a gente tem investigação do Gene do receptor de progesterona

enfim não é possível obter chips já prontos como a série de higiene sou é possível até mesmo customizar não seja pedir Quais são os genes que a gente quer investigar e como é que acontece hibridização Então esse esquema que ele mostra muito claramente né que a gente vai ter então aqui o suporte de vidro de quartzo aqui as sequências das ondas na em cada. Vejam que são sempre a mesma sequência e aqui amostra sendo colocado seja ela ontem afta simples ou se DNA se a gente quer avaliar a expressão gênica aí as sequências se forem

complementares as ondas a sequência da amostra dos fragmentos da Mostra eles vão fazer a ligação nessa sonda e se não forem complementares eles não vão fazer ligação e vão ser lavados ao final do processo e essa outra imagem aqui ela demonstra todo o processo de avaliação da expressão gênica utilizando uma Crowley tão detalhes que são importantes né que eu já comentei e reforçando aqui as ondas identificam genes específicos então cada um desses pontos tá investigando um gene específico neste caso aqui diferente do sol tão blot onde a gente tinha uma sonda marcada com radioatividade em

neste caso na numa criei as ondas não são marcadas nem com radioatividade nem com fluorescência o que realmente vai ser marcado vai ser a mostra neste caso aqui como a gente está falando de análise de expressão gênica a marcação da mostra vai ser feita quando se converte né quando se faz uma cópia do RNA mensageiro esse DNA Então a gente tem aqui duas Amós os dois tecidos né dois organismos diferentes se fez a extração do RNA mensageiro deles e se faz uma reação com a transcriptase reversa fazendo uma cópia do RNA mensageiro in C DNA

E aí se adicionou nucleotídeos marcados com fluorescência e a mesma coisa é feita por outro tecido para o outro organismo né também se faz assim se Descer DNA só que dessa vez o flor o flor o Cromo que é adicionado um dos dntps ele vai ser diferente do que foi adicionado aqui para essa mostra Então a gente vai ter duas amostras marcados com a gente de florescência diferente e depois que você DNA foi produzido ele pode ser misturado ele é em colocado em contato então com chip ou seja na presença das ondas e onde houver

sequência complementar a esse CDN as eles vão fazer a ligação então a gente pode ver aqui embaixo que em alguns pontos houve uma ligação única e exclusiva do CDN as que tinham a gente de fluorescência verde em outros pontos aqui aqui a gente tem a ligação exclusiva do CD nha que tinha fluorescência vermelha em alguns pontos que estão marcados em amarelo a gente tem aqui tanto a hibridização do CD na marcado com verde quanto dos e DNA marcado com vermelho que que isso significa que o gene que estava nesta posição aqui onde eu tenho a

pena a linha marcado como Verde este Gene aqui era Expresso neste tecido já é este Gene aqui e ele era Expresso apenas nesse tecido apenas nesse organismo já é assim esses genes aqui que estão marcados em amarelinho eles tinham uma expressão tanto no tecido quanto no outro né claro que essa leitura ela não é feita manualmente né ela precisa ser feita e a partir de um scanner porque a emissão de fluorescência ela deve ser quantificada E também como a gente tem dados para muitos genes né são muitas sequências que são analisadas simultaneamente a gente precisa

de um software para fazer essa análise e essa imagem aqui ela mostra também a questão da intensidade da fluorescência né então como a gente viu cada uma das moléculas dos e DNA e marcado com a gente de fluorescência Então se a gente tem bastante deste a Renner mensageiro a gente vai ter muitos e DNA marcado com fluorescência com essa sequência ou seja praticamente todas as ondas que tiverem nesta posição vão ter amostra ligada E aí ele vai ser emitido uma fluorescência intensa já em alguns pontos a gente pode ter um pouco menos de moléculas de

ser DNA marcadas né ou seja de tinha um pouco menos de expressão daquele Gene então a intensidade da fluorescência vai ser um pouquinho menor então uma Correia além de identificar a presença do RNA mensageiro que foi convertido em seu DNA ele é capaz de quantificar e por cima ele pode como a gente estava mostrando nesse esquema de uma análise de expressão comparativa né então uma expressão relativa vamos voltar aqui um pouquinho eu vou comparar a expressão e dessa mostra em relação a esta né o vice versa é possível também fazer a avaliação da expressão absoluta

mas o mais comum que a gente mais vê é avaliação da expressão relativa bom então aqui essa figura ela mostra né como seria eu prefiro tirando obviamente não consegue veio só olho nu né mas cada um desses pontinhos está investigando a presença de um gene e análise Então por Bill informática é como eu falei no início a outra aplicação dos macroway só para nariz e Deslizes né então Relembrando dos slips a troca de um nucleotídeo para o outro como que ele vai funcionar vai funcionar de uma forma muito parecida com análise de expressão só que

em cada ponto ao invés do estar investigando a presença de um gene e eu vou vou estar investigando a presença de um Alelo então aqui eu exemplifiquei iam a sonda um tá investigando Alelo um que é o alelo G tá nesta posição aqui da placa e aqui estou mostrando como é que a sonda com o alelo um já na outra posição eu tenho ponto onde eu tenho a sonda para o alelo dois que é o alelo que tenha adenina no lugar da guanina bom então para cada snip que você investigado eu vou ter: né eu

vou ter um ponto com a sonda para um dos alelos e o outro ponto com a sonda para o outro Alelo e a leitura também é feita por scanner né e os dados também deve ser interpretados usando ferramentas de bioinformática é aquele mostra um pouquinho melhor a questão das ondas de genotipagem né como é que ocorre o pareamento sendo que tenha troca de um nucleotídeo único dentro da sonda E aí e Resumindo a técnica de macroway na ela permite tanto análise de expressão gênica old esnips em larga escala é para quem que avaliar muitos genes

são muitos polimorfismo sal mesmo tempo e as ondas são pequenos fragmentos de DNA fita simples não marcados com radioatividade inflorescência mas imobilizados em um suporte então cada um daqueles pontos o software que o aparelho vai utilizar para ler ele é informado de qual Gene tá em cada um daqueles pontos e por isso ele consegue fazer a leitura as ondas não são marcadas nem com radioatividade nem com fluorescência as amostras que serão marcadas com fluorescência e como geram muitos dados é preciso utilizar ferramentas de informática para fazer análise final