Aula 5 ACH5542 - Aminoácidos, peptídeos e proteínas - Parte 2

Oi bom dia pessoal tudo bem com vocês aqui quem fala é brisa novamente e hoje a gente vai continuar com a parte 2 da aula aminoácidos peptídeos e proteínas bom então hoje a gente vai falar um pouco sobre trabalhando com proteínas e vamos entrar na estrutura de proteínas salão da estrutura primária como lá é bom para um pesquisador se ele quer estudar uma proteína se ele quer trabalhar detalhadamente proteína primeira coisa que ele precisa fazer é isolar essa proteína de uma solução por exemplo tem a proteína de interesse ele precisa isolar essa proteína purificar proteína

para depois saber determinar suas propriedades Então hoje em dia já Existem muitos métodos de separação temos os métodos clássicos que conseguem separar a proteína por diferenças em suas cargas diferença de tamanho ou diferença nas propriedades de ligação por exemplo afinidade de ligação né então você também métodos hoje mas mais recentes como a coragem de Dani ao sequenciamento genômico só que esses métodos recentes eles fazem muitas vezes modificações a proteína que vai ser purificada é eles podem adicionar aminoácidos alguma das e isso traz consequência né porque uma vez que você adiciona os aminoácidos na cadeia uma

estrutura proteica isso pode alterar potencialmente a função da proteína porque uma vez que Você alterou a estrutura primária estrutura primária ela afeta diretamente no enovelamento protéico e consequentemente na sua função em função da proteína Então hoje a gente vai falar um pouco sobre os ventos separação clássicos que são métodos de separação e não alteram a proteína então de trabalha com a proteína em seu estado nativo mesmo original de fábrica do jeito que foi sintetizada gente é bom sempre lembrar né aqui não pesquisador vai trabalhar com proteínas ele sempre deve trabalhar com proteínas nem baixas temperaturas

dizer a 4° porque as altas temperaturas elas fazem o que a proteína ela vai a desnaturar bom então eu tenho desnaturada ela perde sua função e por isso deve sempre trabalhar com a proteína em temperaturas baixas é bom primeiro passo para um pesquisador é purificar-se a Carol a proteína é liberar proteína no extrato bruto então ele vai promover e o rompimento da célula Deixa eu tirar esse daqui para aí então ele precisa liberar essa proteína no Extra do bruto então ele primeiro vai ter que romper a célula na Qual a proteína de interesse se encontra

pode ser a serão de acontecido uma célula microbiana a célula onde a proteína de interesse se encontra precisa romper liberar ela no extrato bruto isso pode ser feito através da centrifugação diferencial Vocês já viram aí nas aulas anteriores Então os métodos de separação na verdade eles fazem o fracionamento de uma de uma solução separe diferentes frações né De acordo com a e nesse caso a propriedade da solubilidade vai separar as proteínas e de acordo com a sua solubilidade então nós temos aí o Salt insulting e saltinho áudio que isso é para as proteínas é a

partir da concentração de sal presente na solução então a quantidade né do sal concentração de sal presente na solução pode aumentar ou diminuir a solubilidade de uma proteína em questão ou várias né então Salt in ele causa o aumento da solubilidade porque a dissociação do sal ele vai liberar íons que passa a interagir com as moléculas da proteína e isso vai diminuir a interação proteína-proteína aumentando então a solubilidade da proteína um toque Audi é o contrário ele diminui a solubilidade então a adição de sal em uma concentração correta né pode precipitar seletivamente algumas proteínas e

O sulfato de amônio e é muito esse caso essa precipitação então aqui nesse esqueminha óleo nós temos aqui um volume de amostra com ph né ajustado e aqui a gente coloca a gente vai adicionar sulfato de amônio e aí misturamos e aí a gente consegue a partida o aumento da concentração do sulfato de amônia do sal a gente já consegue ver a precipitação aqui das proteínas Então esse é um método de separação bem simples e a gente consegue ver a olho nu Lu e no recipiente como as proteínas elas são separadas né pela sua precipitação

Tá bom uma vez que as proteínas pode puderam ser separadas por solubilidade né pela precipitação a partir da adição do sulfato de amônio responde também posteriormente ou uma outra técnica de separação promover a diálise que a diálise diálise é quando você precisa né fazer a modificação da solução na qual está a sua proteína de interesse então por exemplo se nós precisamos a proteína com a presença do sulfato de amônio então agora a gente pode fazer a diálise para remoção desse sulfato de amônio Então o que acontece é essa nossa proteína tá aqui com a nossa

solução a gente coloca ela em um saco saco de diálise e esse saquinho ele ele tem uma membrana não é um saco é um saco semipermeável então e vai permitir a troca de sal EA troca de tampão com a sua solução que tá dentro do saquinho e a solução que era o recipiente do lado de fora porém ele não permite a saída da sua proteína então ele só vai permitir a troca de sal EA troca de solução tampão então ele vai fazer essa troca alterar a concentração aqui do sal até atingir o equilíbrio com a

solução de Fora Oi e aí se a gente quiser tirar todo né gente quiser tirar todo o sal da nossa da nossa solução a gente faz processo várias vezes até que todo o sulfato de amônio tenha sido retirado da nossa da nossa mostra que da nossa solução eu utilizo esse essa técnica né eu faço diálise para remover o imidazol da minha solução então quando eu purifico a proteína e eu preciso imidazol na minha técnica at Purificação que vou falar um pouquinho mais para frente utiliza imidazol como a cromatografia de afinidade então eu utilizo me dá

só vi depois que a proteína purificada eu preciso tirar preciso remover e me dá logo a minha solução então eu faço a diálise e dessa forma eu consigo remover o imidazol então a diálise serve para você modificar a sua solução né retira a sal ou um lugar em tampão alguma dessas a pressa substâncias e tem que deixa eu só confirmar que está gravando que já é uma vez eu gravei e não tava saindo áudio sabe então Deixa eu confirmar aqui rapidinho você tá gravando e tá gravando tudo bem Então vamos continuar bom aí a gente

já vai agora para os métodos cromatográficos bons métodos cromatográficos Eles são muito mais eficientes e eles podem purificar Separar uma proteína a partir do seu tamanho da sua carga ou da afinidade de ligação entre outros fatores né mas esses três fatores são os fatores mais utilizados bom essa separação vai depender da velocidade de migração EA velocidade de migração vai depender da propriedade de proteína então cada sua proteína tem uma propriedade que vai fazer com que ela migue mais rápido ou mais lentamente e essa velocidade é que vai separá-la de outras proteínas e os métodos cromatográficos

eles possuem duas fases uma fase estacionária e uma fase móvel sempre então todo médico cromatográficos é possui duas fases uma estacionária e uma fase móvel e o que acontece nesse esqueminha é que a sua solução a sua a sua mostra né contém da sua proteína ela vai migrar ela vai correr sobre essa fase estacionária e a diferença de velocidade dessa migração é que vai fazer com que a proteína seja separada do restante da solução então aqui a gente tem um exemplo bolinhas vermelhas ou não tipo de proteína e os quadradinhos azuis o outro tipo e

aqui Eles correm em velocidades diferentes fazendo com que a proteína da Bolinha Vermelha seja Lu ida mais rapidamente que a proteína Azul essa forma se separando o e pelo fracionamento né É porque essa luz são ocorre e após essa corrida né a solução ela vai cair em frasquinhos né frascos diferentes então tempo de corrida que vai fazer com que a sua proteína seja separada o ponto existem vários tipos de cromatografia né aqui existem tipos de cromatografia e as formas de cromatografia na verdade então a cromatografia de adsorção é uma cromatografia que utiliza uma fase estacionária

sólida e uma fase móvel líquida ou gasosa Então o que acontece na fase estacionária sólida e essa bola cinza que é a fase móvel né que é a fase contendo sua sua proteína de interesse sua solução ela vai correr por essa fase estacionária e a sua proteína ou o que você quer purificar vai se prender a essa fase estacionária Por algum motivo não fala mais na frente ou por afinidade de ligação ou por interação de carga então ela vai se prender nessa vai estacionária e vai ela vai demorar mais para ele ir ela vai ficar

presa aqui enquanto outras proteínas passam e ela só vai passar depois de um tempinho e vai demorar mais essa forma separando é isso a proteína das outras temos a cromatografia de partição é uma fase estacionária se forma uma camada o em volta né dê um suporte sólido e o soluto soluto ele vai ficar coberto por essa camada ela superfície sólida então é mais ou menos parecido com a diálise uma vez que a sua proteína de interesse ela vai ficar protegida né aqui dentro dessa camadinha fina aqui encontra outras proteínas passa nós temos a cromatografia de

troca iônica aniônica é uma cromatografia que separa nas proteínas pela diferença de carga então aqui deixa desenho nós temos a troca iônica temos troca catiônica e troca aniônica Então nesse desenho A gente tem que um exemplo de cromatografia por troca catiônica não desculpa troca aniônica que a sua matriz ela está revestida que está revestida com grupos carregados positivamente então esses grupos carregados positivamente estão presos aqui na sua fase estacionária e a sua fase móvel que a solução que contém a sua proteína as proteínas que tem ânions móveis vão se ligar aqui vão interagir aqui com

a o grupo de carga positiva tão grupo os grupos contrário né contrários eles têm afinidade eles se atraem então aqui em uma troca iônica puro positivo para atrair negativo e vice-versa nessa troca iônica gente é utilizado uma resina então a parte da da resina você escolhe resina que melhor vai atrair a proteína que você quer separar nessa troca eólica também existe as duas coisas que podem afetar a afinidade a proteína uma delas é o PH uma vez que o estado de ionização da molécula depende além do PH se o PH for muito ácido por exemplo

a molécula vai estar completamente protonados se o PH for muito básica moleque ele vai estar desprotonado então definir aí qual PH da solução vai correr aqui na fase estacionária é importante pode afetar aí essa afinidade EA concentração de íons também e longe de sais também podem afetar afinidade por competição então eles podem competir com a sua proteína para se ligar aqui na sua resina E aí e dessa forma muito da sua proteína né pode não se ligar e pode ser lavado nesse primeiro momento da cromatografia o que não é bom quanto mais proteína Você conseguiu

verificar melhor então toma cuidado aqui com a quantidade né concentração de sal e com PH da solução é temos também a cromatografia por exclusão molecular pode ser também chamada cromatografia de filtração em gel que é uma cromatografia que na verdade ela vai impedir umas algumas moléculas né passem deprimente que acontece tem molécula é e é por tamanho né vai separar aqueles moléculas para o tamanho Então o que acontece a fase estacionária é um polímero 3 uma coluna E aí passar fase móvel caça moléculas pequenas moléculas pequenas ficam presas nesse polímero aí depende ainda por unidade

do polímero do tamanho das moléculas que você vai o que você vai correr né EA concentração do seu o livro vai ser de acordo com o tamanho de molécula que você quer reter E aí essas moléculas entram nesse polímero e demoro mais tempo para sair dele e eu ir nessa fase estacionária e temos ainda formas né de cromatografia temos a cromatografia em coluna que pode ser utilizada e para várias vários tipos né de cromatografia como a troca iônica como a portabilidade é só uma cromatografia manual e coluna e teve também a tomografia de Alta alta

resolução ou hplc que também é utilizado uma coluna temos a cromatografia gasosa o tema cromatografia que separa moléculas de gás Então você para moléculas na forma gasosa também pode segura afinidade pode ser por aqueles todos aquelas propriedades que eu falei agora eles são formas diferentes vamos cromatográficas diferentes de separação em cromatografia planar que é uma cromatografia né que a gente usa no papel em que usa fases estacionárias líquida EA camada delgada que utiliza que ela faz estacionária sólida e o desenho da cromatografia delgada e é uma cromatografia por absorção Então as moléculas elas vão ficar

presa aqui nessa camada né E aí a fase líquida vai passando aqui e elas vão migrando de acordo com seu com suas diferenças com as suas diferentes propriedades ó e aqui a cromatografia gasosa a gente coloca aqui a nossa amostra e ela passa por uma coluna nessa coluna que a cromatografia a gás Então a nossa injeção aqui nossa mostra é gasosa e as moléculas ficam presas aqui nessa coluna eluindo mais lentamente que outras outras substâncias pode ser também por afinidade e por por carga e por aí vai é a então eu não sabia que não

tinha falado ainda da cromatografia de afinidade Então existe também a cromatografia de afinidade onde as moléculas elas podem ser se elas são separadas que ela especificidade de ligação Então como acontece essa cromatografia de afinidade aqui ó cromatografia de afinidade em coluna onde é o pesquisador né quiser Separar uma molécula uma proteína ele vai preencher essa coluna com uma solução que contém um grupo de ligação que é afinizado com a proteína que ele quer separar por exemplo eu faço Purificação lá no Lab laboratório o meu projeto E aí eu utilizo essa cromatografia por afinidade então eu

sei que a minha proteína ela Boa tarde ligação com níquel Então o que eu faço Eu preencho essa coluna com níquel então eu coloco aqui moléculas de Nico e aí quando eu coloco a minha a minha solução com minhas proteína ela vai correr aqui por essa fase estacionária contendo níquel E aí por afinidade a proteína que eu quero separar que eu quero purificar vai se ligar as moléculas de nível que estão presas na coluna bom então o restante das proteínas que tem nesse solução né pra mim solução não está uma solução tem várias proteínas o

restante delas que não vai se ligar o link ou vai ser lavado vai ele ir primeiro e vai ser fracionada aqui nos tubinhos aqui de eluição nesses recipientes de água e sal então esse primeiro momento minha proteína vai ficar presa aqui por afinidade de ligação com níquel eu sei isso tem que saber que a minha proteína tem afinidade de ligação com o link ou por isso que eu coloquei um vídeo aqui para ela se ligar nele numa segunda fase eu coloco uma outra solução geral meio gente são soluções tampões esse aqui a gente chama de

tampão ao tampão b o tampão lá é um tampão sem olhar o meu ligante o tampão B que eu vou colocar agora é uma solução que possui um ligante Essa é a minha proteína que vai competir por afinidade Então eu tenho aqui um gigante que vai competir com a minha proteína por afinidade uma vez que eu coloco é uma solução contendo ligantes para correr na minha coluna essa competição vai fazer com que as minhas moléculas com os moleque que as moléculas de proteína se sol tem do níquel e dessa forma elas são iludidas após eu

adicionar aqui um gigante na coluna uma solução contendo esse elegante Então nós vamos ligar a minha proteína você desligado vão se diz afinizar né nem eles assim já elas só vão perder essa ligação que Cone Crew em seus filmes Anime vai aprender a ligação com nível e vão ser Helô idas posteriormente tô aqui eu tenho aqui o funcionamento dessa erros sol hoje no primeiro momento eu tenho as proteínas Gerais que não tem afinidade e nesse momento a partir do momento eu coloco essa solução eu tenho a minha proteína é purificada aqui Teoricamente é purificado G1

bom então vamos resolver um exercício Zinho rapidinho esse exercício Castelo livro de vocês pararam para estudar alguma coisa Vocês viram ele lá então aqui ó pesquisador ele que é separado dois peptídeos por cromatografia de troca iônica a gente já sabe que a cromatografia por troca iônica vai separar as moléculas a partir de suas diferenças na carga então aí um PH da fase móvel a ser utilizado um de prestígio a possui carga final menos três porque esse petijo a eles têm mais resíduos de glutamato e aspartato né são aqueles aminoácidos que são carregados negativamente em teve

uma tabelinha e na aula anterior e glutamato e aspartato são aminoácidos polares carregado negativamente então tapete gente que tem muito glutamate Muitas para cada um e vai ter uma carga vi não negativa né obviamente e o partido B tem uma carga final positivo mas no final mais um cão que tá perguntando qual o teu tio irá incluir primeiro a partir de uma resina de troca catiônica então gente uma resina de troca catiônica e ela tem uma matriz com grupos carregados negativamente então uma troca catiônica tem uma matriz com grupos carregados negativamente ela vai atrair né

grupos positivos porque as trocas é a cargas Opostas né se atraem Então se uma troca catiônica contém grupos Resgate negativamente atrair a e os grupos que tem carga positiva é isso quer dizer que o grupo B é o que tem carta positiva vai ser atraído por essa troca por essa Matriz aqui contendo grupos negativos presos nela Então uma vez que o permitido B vai ficar preso aqui né parte se vai se interagir aqui com esses grupos ligados negativamente isso quer dizer que o repetir de bebê vai demorar mais tempo para eu ir então qual o

tempo de ir primeiro o peptídeo a como ele não possui uma carga positiva ele não vai interagir com a matriz e também contém grupos carregados negativamente ou seja o peptídeo a irá incluir primeiro que o peptídeo b em uma troca aniônica ocorre exatamente o contrário né já que a matriz de uma troca aniônica ou tem grupos carregados positivamente bom então ele vai atrair né ele vai se interagir vai interagir interagir com parte do arco possui carga negativa fazendo com se o PT do b e Lua primeiro então a resposta para essa questão seria o peptídeo

a tem troca negativa então ele vai ir primeiro Que partido B porque o tapete de bebê vai demorar mais Neve São pela sua interação aqui de carga com a matriz negativa é um problema de dessas técnicas cromatográficas é que quanto maior é o tempo né de eleição tempo de corrida mais dispersão por difusão a nessa solução e isso diminui a resolução de uma Purificação então métodos né eles podem ser aperfeiçoadas então foi criado a cromatografia líquida de alta performance a gente chama de hplc então hplc um equipamento que fala cromatografia líquida e faz a reprografia

em uma alta performance como ele faz isso então um hplc ele possui bombas de alta pressão que aceleram o movimento dessas moléculas e na coluna bom então ele acelera o movimento da nossa mostra passa mais rápido pela coluna isso também ajuda porque em um hplc deve ser utilizados materiais cromatográficos de melhor qualidade né Justamente que suportam a pressão que essas bombas colocam aí nesse nesse movimento e isso também demora muito menos tempo isso faz com que o tempo seja menor então é menos tempo de trânsito na coluna e isso limita de expressão e consequentemente melhorar

a resolução de uma purificação eu estou aqui gente é um esqueminha bem simples pode-se utilizar no O que é o esquema de purificação pelo hplc então aqui a fase móvel aqui a gente vai passar essa fase móvel né que é uma solução contendo tampão No meu caso eu utilizo a pena de ser para Purificação alo o meu projeto EA utilizou a fase móvel utilizo dois tipos de tampão já que a minha Purificação é por afinidade né Eu tenho um tampão passa na bomba ele é injetado essa bomba injeta aqui com muita pressão esse tampão E

aqui onde até minha mostra a minha mostra passa aqui pela coluna e ela cai em um detector ela é Luiza aqui na coluna e caiu um detector para depois cair aqui uns tubinhos aqui fracionado e esse detector ele ele me mostra né no uma tela de em Picos então ele vai me mostrar Picos e cada pico corresponde a uma proteína então no minha na minha Purificação né posso dar o exemplo que eu faça né o exemplo prático que eu digo que eu faço um laboratório é como a minha Purificação é por afinidade então o primeiro

tampão que passa pela minha coluna junto com a minha mostra ele vai lavar as proteínas E aí a primeira o primeiro pico que eu vejo no registrador é um pico Bem largo que me mostra que proteínas Gerais várias proteínas estão caindo aqui nesse primeiro momento uma vez que eu coloco o segundo tampão no tampão que tem o ligante para se ligar na minha proteína para ela desprender da coluna passa pelo detector e como é Teoricamente né Deve ser uma proteína só o pico será mais estreito e tem a presença de proteína ali ó E aí

e é uma técnica também gente que a gente utiliza muito é a eletroforese que é eletroforese eletroforese é a migração de proteínas carregadas em um campo elétrico mas o que acontece para Purificação A eletroforese então é utilizada não é muito utilizada por que esse método ele afeta a estrutura da proteína e consequentemente afeta a função dessa forma a eletroforese era mais utilizada praticamente ela é utilizada para identificação de alguma proteína de interesse ou de alguma substância ela pode ser também utilizada para estimar a massa molecular e pode ser utilizada para determinar o ponto isoelétrico de

uma proteína Então ela é utilizada para identificação massa molecular e determinação do PPI como é como é desenvolvido essa técnica né e aqui está uma Cuba recipiente na casa da Forever é feita e aqui a gente tem um gel de poliacrilamida em gel de poliacrilamida é o gel que a gente utiliza para fazer né a identificação de proteínas porque acrilamida sei lá me dá um polímero a dependendo da concentração ele vai ser mais poroso ou menos poroso e vai fazer com que as moléculas migrem e velocidades diferentes dentro do gel o fds e também colocado

na solução é ele é colocar na verdade na solução tampão de corrida e vai ficar envolvendo gel né E o que ele faz o SDS na verdade é uma A gente ajuda a desnaturar desnaturar a proteína ah e também a presença do STF faz com que todas as cartas né as cargas Gerais das moléculas tenham uma carga negativa isso faz com que todas as moléculas tenham praticamente a mesma carga então quando a presença do SS a cara da molécula é diz considerada então a migração Ela depende quase exclusivamente da sua massa molecular então em um

gel de poliacrilamida SDS as moléculas serão separadas a parte de seus de suas massas moleculares e também adicionamos um corante para visualização esse corante ele adicionado depois da corrida quando você termina a corrida você tira o gel na cuba e coloca o corante em gel esse corante ele vai formar ligações e com as proteínas estão presentes no Gel então e aqui está né a imagem de um gel e aqui todos esses é pontos nessas bandas azuis são proteínas que ficaram presas no Gel Por que migraram de formas de em velocidades diferentes aqui é né nesse

gel então gente a migração ela é vertical Então a nossa mostra né que a gente quer identificar ou para Qual objetivo tiver a gente coloca aqui as amostras nesses postos chamam de Poços E aí a gente liga aqui um campo elétrico nessa Cuba e esse campo elétrico vai promover a migração das moléculas da forma vertical e aí a velocidade de migração vai depender dos fatores aí de massa molecular de cada molécula e são eletroforese poliacrilamida SDS tá bom gente então aqui a gente consegue a realizar Michel as bandas tocada bomba dessa é uma proteína que

né corante serve para visualizarmos hoje tem proteína o gel então aqui ó a gente pode ver nesse primeiro nessa primeira coluna temos marcador o marcador molecular ele é utilizado para este mar a massa molecular nessa nessa imagem aqui no cantinho a gente pode ver quando a gente precisa estimar a massa de uma molécula a gente tem uma proteína que a gente desconhece né sua massa a gente coloca aqui um marcador molecular que é uma uma uma mostra né contendo proteínas que a gente já sabe quais são as massas moleculares delas eu esse marcador é comprado

então ele já vem pronto com todas as proteínas de massas moleculares que a gente quer que a gente sabe quais são né o e colocamos aqui nessa mostra para correr lado a lado com o marcador então uma vez que a gente corre o gel a gente consegue visualizar nossa banda gosta proteína desconhecida E aí por meio de comparação aqui a gente consegue estimar mais ou menos qual seria a massa molecular da nossa proteína e nessa imagem animais desse gel a gente consegue visualizar como se deu a purificação dessa proteína Olha que legal que o marcador

pra gente conseguir já estimar a massa molecular da nossa proteína aqui ó tem os células não induzidas células induzidas e temos o extrato bruto solúvel O que são células não induzidas e células induzidas a gente coloca para crescer né no meio é e peito do mais a célula contendo o gene que vai expressar nosso proteína de interesse então uma vez que a gente deixou crescer essa é a nossa célula a gente vai adicionar um indutor que que me Doutor faz o indutor ele vai induzir a expressão da nossa proteína Então essas células Não induzidas elas

expressam outras proteínas que as células o nosso gênio não vai ser expresso é o gene que expressa a proteína que nós queremos né que nós proteína de interesse não vai ser expresso ou seja não tem a síntese da proteína que nessas ela já na célula induzida a gente já colocou o indutor no meio e esse indutor vai promover a síntese da nossa proteína e nessas células aqui então aqui a gente consegue ver a diferença a presença da proteína que a gente quer aqui né nas células induzidas e a ausência da proteína que nas células que

não foram divididas então nós essas bactérias né ela só vão e ela só vão expressar o gene Quando nós induzir vamos nessa expressão aqui o extrato grupos ouviu naquela primeira etapa o pesquisador precisa separar a proteína para vocês verem como tem várias proteínas no extrato bruto Mas a nossa proteína tem uma banda bem grandona que isso quer dizer que tem muita quantidade da proteína no extrato aqui a precipitação por sulfato de amônio que a separação lá pô solubilidade já consegui separar muito muito bem só tem aqui uma bandinha aparecendo aqui embaixo quer dizer que tem

um pouquinho de uma outra proteína aqui a cromatografia por troca iônica aniônica e a cromatografia por troca catiônica de umbanda nas duas quer dizer que a nossa proteína ela pode ser purificada tanto por carga negativa né quanto por carga positiva e aqui a proteína purificada então a gente conseguiu purificar pro há mais ou menos aqui pela precipitação e pelas cromatografia de troca aniônica e catiônica E aí bom então gente nada para Floresta a gente consegue identificar Nossa proteína a gente consegue estimar a massa da proteína e a gente consegue também determinar o ponto isoelétrico como

que a gente utiliza eletroforese para determinar o ponto isoelétrico de uma proteína a gente pega um gradiente de PH Então esse gradiente de PH a gente põe a proteína aqui na extremidade de uma fita de gel E aí o gradiente de PH ele vai fazendo com que o PH de cresça ou cresça né aqui nesse caso nessa imagem o PH é de descrescente então PH vai de ácido para básico e a proteína vai migrar até que ela atinja o seu ponto isoelétrico quando ela tinha o ponto isoelétrico ela para a migração e fica parada na

frente do gel naquele ponto que é o ponto isoelétrico dela então aqui a nossa moto e aqui na extremidade da fita coloca o campo elétrico EA partir disso a proteína vai migrar É nesse gradiente de PH até atingir o seu ponto isoelétrico bom então se nós conseguimos fazer eletroforese SDS para determinar a massa molecular e conseguimos fazer um eletroforese de focalização isoelétrica para determinar o ponto isoelétrico da nossa substância da nossa molécula né então a gente consegue também fazer os dois juntos porque não então a eletroforese bidimensional ela é utilizada quando a gente precisa ou

separar proteínas de mesma massa molecular só que com pontos isoelétricos diferentes ou se a gente precisa identificar ao moléculas com massas moleculares e é diferente só que compensa É melhores e o processo é o mesmo a gente consegue fazer as duas coisas só que primeiro né no primeiro momento é a molécula vai migrar de acordo com o seu sua carga seu ponto isoelétrico tô ela migra primeiro é na focalização isoelétrica e uma vez que ela parou aqui no seu ponto isoelétrico ela vai migrar verticalmente para que possa ser descoberta nem a gente possa identificar a

sua massa molecular então primeiro aqui nessa eletroforese bidimensional primeiro a proteína vai migrar na forma horizontal até se determinado o seu Pein e depois ela mira na forma vertical e a gente consegue estabelecer Qual é o ponto de um elétrico e qual é a massa molecular da nossa proteína de interesse que a gente precisa que a gente quer trabalhar então aqui é uma imagem mostrando o resultado dessa eletroforese bidimensional e a gente consegue ver cada um e esse como uma proteína de um certo. Isoelétrico e de uma certa massa molecular e e aqui a gente

consegue até ver o autor exemplo esses dois pontinhos eu proteínas que tem a mesma massa molecular para que quase igual né vou dizer a mesma não é muito próximo elas são regulares podem Elas têm pontos isoelétricos distintos uma vez que essa proteína aqui né ela tá ela tá um pouquinho mais à esquerda da proteína de carro e é nós também conseguimos né no caso de enzimas são proteínas possuem atividade catalítica conseguimos quantificar enzimas sem precisar purificá-las por que que a gente consegue fazer isso com enzimas como as enzimas Elas têm atividade catalítica né Elas podem

ser medidas nos termos do efeito catalítico que elas produzem Então o que acontece o aumento da taxa de conversão do substrato que a enzima é transforma em produto E para isso acontecer pra gente conseguir pode ficar uma linha sem precisar primeiro purificar separá-lo um pesquisador ele deve conhecer as características da sua enzima em questão então ele tem que saber qual que é a temperatura ideal de de atividade Qual é o PH ideal de atividade para dessa forma ele poder quantificar ela sem precisar primeiro separar gente só beber uma gripe A é bom em geral a

quantificação dessas enzimas de uma enzima né seria o que descobri a quantidade necessária de umidade de enzima e para converter um molde substrato em produto por minuto então se eu quero codificar uma enzima o que eu preciso descobrir qual é a quantidade de enzima que eu preciso que vai conseguir converter um molde substrato em produto em um minuto então a quantidade de enzima que eu preciso ter na solução para que eu consiga transformar o substrato que ela realiza atividade né em produto em um minuto é uma unidade de ensino bom então por exemplo se eu

preciso de menos em cima né se a quantificação da menina moça que eu preciso de menos em cima para fazer isso é uma convenção lá e Internacional que teve eles decidiram que unidade de enzima necessária para converter o nosso substrato em produtos Um minuto é aquela unidade de enzima e é isso então agora nós vamos entrar um pouquinho gente na estrutura das proteínas eu falei aí começo que nós vamos falar da estrutura primária de proteínas mas eu trouxe essa imagem aqui para vocês se vocês viajar se apresentando eu vou apresentar para vocês aqui que Apesar

dele nos falamos apenas da estrutura primária das proteínas elas possuem quatro níveis de estrutura então aqui a gente tem a estrutura primária O que são os resíduos né de aminoácidos que são ligados equipe ligações peptídicas temos a estrutura secundária que é esse estrutura primária né ela forma ligações aqui de hidrogênio entre um aminoácido aqui outro fazendo com que essa forma aqui nessa hélice Alpha seja possível E também tem uma outra forma de estrutura secundária chamadas de folhas Beta que vocês vão estudar e na próxima aula temos aqui estrutura terciária e é uma cadeia polipeptídica né

então é a estrutura primária forma da estrutura secundária e essa estrutura secundária ela forma a estrutura terciária promovendo aqui o enovelamento tridimensional Então ela interações né e ligam aqui entre a cadeia a cadeia política aqui é o povo interações que vai fazer com que a proteína tem a essa estrutura terciária aqui chamada de enovelamento tridimensional e uma estrutura quaternária nada mais é do que várias subunidades de estrutura terciária Reunidas aqui em uma estrutura quaternária isso tudo gente conseguir de ações Tá bom então aqui cada estrutura dessa vai ter um tipo de ligação a gente vai

estudar aí nas próximas aulas on bom então na estrutura primária O que é estrutura aqui né de resíduos de aminoácidos elas vão ter diferenças informativas então cada proteína ela tem o sequenciamento específico e esse sequenciamento específico é que vai determinar como que ela vai se dobrar como que ela vai promover esse enovelamento tridimensional aqui da estrutura terciária e aí esse nó velamento essa estrutura espacial que vai determinar a função né que vai fazer com que a proteína desempenha e sua função bom então gente é a gente consegue ver que a estrutura primária afeta diretamente na

função da proteína então uma proteína que tem algum algum defeito né na sua estrutura primária elas são proteínas defeituosas e elas podem e não desempenhar sua função corretamente ou Elas podem até ser inativas perdendo completamente sua função é tá então existem proteínas por exemplo que tem substituição de algum aminoácido por outro em uma parte crucial nenhuma sequência crucial da proteína que a substituição de um aminoácido por outro por exemplo pode causar uma doença grave é transporte exemplo vocês verem como é a substituição do aminoácido ácido glutâmico pelo aminoácido valina em uma das cadeiras da hemoglobina

faz com que a hemoglobina que tem aqui essa substituição tenha uma forma estrutural distorcida e não consiga desempenhar a sua função corretamente então gente e a hemoglobina que tem substituição nesse aminoácido aqui nesse esse resíduo de menor substituído pela valina ela vai apresentar uma forma completamente distorcido especial forma de foice e ela não vai conseguir carregar oxigênio suficiente para as células então apenas a substituição desse aminoácido por esse causa a anemia falciforme que a gente veículo que eu mando doença grave e anomalia estrutural né que a hemoglobina em forma de moeda nem forma Redonda ela

fica com forma de foice justamente pela troca aqui desses dois aminoácidos e tem também a deleção a seleção de genes que codifica uma proteína bom então uma proteína é sintetizada a partir do gênero temos lá no DNA nós temos genes e esses genes são responsáveis pela síntese de proteínas Então como uma proteína ela é sintetizada né Então tá lá no nosso DNA ao nosso DNA é cheio de genes cada Gene ele vai sintetizar uma determinada proteína bom então a deleção um pedaço do Gene ela vai formar né uma proteína muitas vezes e Nativa porque a

sua estrutura primária né seus resíduos de aminoácidos e eles não estão completos então faltam pedaços liga proteína isso pode acarretar aqui isso pode acarretar e o computador ficou doido voltou isso pode acarretar aqui doenças graves né doenças degenerativas muitas vezes porque deleção de alguma parte ou de alguns genes que codificam proteína às vezes DNA tem a deleção do Gene inteiro e aí nosso organismo não produz uma determinada proteína que é necessário isso acarreta e números do Isis nós temos aqui também gente proteínas polimórficas que são proteínas foi Lucas são proteínas podem né É tem variações

dos na sua sequência então uma proteína ela não precisa Obrigatoriamente ter sua estrutura primária completamente fixa então nas proteínas existem sequências que são cruciais ou seja são sequências que não podem ser modificadas se forem modificadas elas vão causar algum dano ao organismo perda de função ou diminuição da sua função enfim essa sequência sociais elas não podem ser modificadas aí existem sequências que são frequências variáveis elas podem variar nos seus resíduos de aminoácido essas proteínas chamadas proteínas polimórficas e as proteínas que tem variações a sua sequência de aminoácidos E aí gente o nosso corpo né de

vinte a trinta por cento das proteínas são polimórficas e todas presentes apresentam alguma variação aí na sua sequência estrutural Tá bom então como que nós vamos descobrir né o sequenciamento de uma proteína como a gente vai identificar aqui um pedacinho né quais aminoácidos Qual é a sequência de aminoácidos presentes uma proteína Então esse cara o Fred Sandy e ele conseguiu desenvolver uma técnica que pode identificar quais aminoácidos estão presentes em pequenos pequenos pedaços né poliptídeos transferência de três formas ele fez primeiro com a marcação do residhome no terminal então o que acontece temos aqui uma

proteína e essa proteína é marcada no seu resíduo amino-terminal esse ácido esse resíduo né da extremidade amino-terminal que é removida sem nenhuma consequência aqui para o restante da proteína Então somente o resíduo amino-terminal removido e depois ele passa por um processo é um processo aí né que processo que ele e vai acabar de bagunçou básico depois a gente uma solução ácida aqui no final ele consegue identificar E qual é o aminoácido que era que estava presente aqui nesse nesse resíduo aminoterminal então ele faz isso né fazer esse circo aí várias vezes e consegue identificar a

um aminoácido de cada vez a partir do seu resíduo aminoterminal é o que ele vai fazer ele vai tirando um resíduo aminoterminal de cada vez uma vez que ele tira esse residual que retira o outro depois de outro depois dessa forma ele consegue identificar o recibo e cada vez a nós temos aqui também a determinação né dá sequência por Hidrólise ácida isso quando você quer determinar uma sequência específica e você utiliza reagentes que clivam a sua proteína em regiões específicas e é de acordo com o aminoácido que você quer que Clive né De acordo com

o aminoácido que você tem algo de clivagem vocês podem usar reagem selecionados para promover essa Hidrólise que libera pequenos peptídeos aí da proteína e também tem a clivagem da proteína em vários peptídeos pequenos e depois é o sequenciamento desses peptídeos e E aí então gente é essa técnica né de sequenciamento da proteína essa desse cara aqui no Fred Ela já foi automatizada e tudo mais e temos aqui a espectrometria de massas que é uma técnica analítica que utilizada para descobrir né identificar aqui sequência de pequenos colectivos e também ela é muito utilizada para descobrir e

a massa molecular e é de de uma molécula é uma molécula em questão é o interesse e essa técnica de espectrometria ela ela consegue medidas altamente precisas e bom então o que acontece né a espectrometria de massas ela trabalha é é e com a utilização de um campo elétrico magnético então é a nossa nossa solução nossa nossa mostra ela e ionizada no espectro leite de Março convencional ela e organizada e depois ela é posta em campo eletromagnético só que isso é feito tá na forma gasosa então primeiro elas são realizadas a vapor e depois elas

são introduzidas em um campo eletromagnético e de forma gasosa né na nossa moça deve ser gasosa E aí ela é linda né o caminho que ela vai percorrer o caminho que a nossa amostra vai percorrer vai ser em uma função né de razão de massa com relação a sua carga Então a primeira coisa que a gente faz quando a gente vai fazer uma espectrometria de massa é ionizar nossa moça Então a gente vai colocar carga na nossa mostra e a partir dessa carga em função de sua massa ela vai percorrer um caminho aí no espectrômetro

Ah e dessa forma a gente pode deduzir a massa da molécula e isso é espectômetro de massa convencional molécula já é realizada há vácuo na forma gasosa e depois ela entra no campo eletromagnético isso é muito utilizado para fazer sequência de pequenos poliptídeos só que macromoléculas aqui nessa forma da espectrometria ela se decompõe aos transferida a forma para a forma gasosa né então ao transferir a molécula para forma gasosa para depois de organizar vácuo ela se decompõe muito facilmente então aqui mal de MS né foi uma técnica que foi utilizada da espectrometria de massas então

mal de MS é uma espectrometria de massas que utiliza e o laser e para ionizar as macro-moléculas na forma líquida Então as macromoléculas que vão se decompor né na forma gasosa elas são postas em uma solução líquida e nessa solução líquida é vão irradiar next peixes aqui de laser e esse laser vai ionizar a molécula numa solução líquida após essa ionização essa Matriz é evaporado solvente são incorporados E aí os seus ficam Livres Para Correr aí o seu caminho no campo elétrico magnético Oi e aí uma técnica ainda mais otimizada né É a espectrometria de

SMS que passa diretamente da forma líquida para fora a forma gasosa sem precisar primeiro ionizar a molécula na forma líquida para depois de vapor a molécula para forma gasosa né Essa técnica qsms ela já vai diretamente da solução para a forma gasosa e organizada como ela faz isso bom Aqui tá um esqueminha do sna que uma uma espectrometria Então essa solução a solução que contém Nossa mostra Nossa mostra em solução ela é dispersado por uma agulha e essa agulha ela é carregada com uma alta voltagem então quando essa agulha faced expressão da nossa mostra ela

já ironiza Nossa mostra de uma vez e essa dispersão aqui vai ser uma névoa é usada nem tô aqui a nossa mostra ela é liberada aqui em forma de névoa já com nossas moléculas e o risadas e elas já entram aqui no campo elétrico magnético que vão que vai fazer a medição aqui nesse espectômetro espectrômetro Então as moléculas elas são ionizadas de acordo com a sua massa em todas as técnicas de espectrometria todas as moléculas são ionizadas e o caminho que ela vai percorrer vai depender da sua massa porque todas as moléculas são realizadas o

que vai diferenciar né é a massa quanto maior a massa mais e uma em cada molécula fica dependendo aí do seu da sua estrutura primária dos seus aminoácidos e tudo mais então Aqui nós temos aqui o detector Oi e esse daqui detector aqui ele pode mostrar para gente exatamente qual é a massa e cada molécula apresenta então aqui é cada pico desse aqui né corresponde a diferença de carga de um e de massa de um tô aqui nós temos uma molécula que tem carga 30 e não 30 mais e aqui de carga massa um a

cada pico desse aqui a molécula vai ter uma massa mais um e uma carga mais um eu estou aqui a relação de massa veste escada e que intensidade reativa da da medição então cada pico desse representa uma espécie que tem uma Lace uma carne que diferem em mim dessa forma a gente pode aqui identificar exatamente Que carga qual é a massa molecular da molécula que está sendo lida aqui E aí E aí e essa técnica também gente também é uma técnica que a gente utiliza para sequenciamento de trechos curtos de boi em peptídeos e bom

então é uma técnica que vai utilizar de dois duas partes né de espectrômetros de massa é e é semelhante né a essa técnica aqui é se então Aqui nós temos a ionização por electrospray são exatamente como essa que eu falei agora mesmo só que a diferença é que na solução que a gente vai colocar aqui na mostra Nossa mostra a gente vai colocar proteases E essas proteases com promover aqui e a clivagem e dessa proteína E aí elas vão promover a clivagem da proteína em vários polipeptídeos menores né mas sofrer que uma fragmentação E aí

a partir dessa fragmentação um dos pequenos polipeptídeos ele vai ser selecionado ele vai para célula de corrosão nessa célula de polysol ele é mais fragmentado e aqui no MS dois que é o segundo espectômetro aqui de massa eles vão ser medidos a partir de suas propriedades similares aqui né então aqui cada pico desse Vai representar um conjunto o conjunto de polipeptídeos um conjunto de peptídeos que apresenta que as mesmas características de quebra bom então aqui conjunto de peptídeos que foram quebrados da mesma forma por exemplo quebra por alguma cargo ou quebra por ligações peptídicas em

um determinado aminoácido e ele gosta juntar aqui no meu espectômetro que dois vão ser identificados em conjunto então aqui cada pico desse é um conjunto de peptídeos que foram privados com as mesmas características de quebra de ligação e o que acontece cada conjunto de pico desse de um para o outro né Cada pico sucessivo tem um aminoácido a menos então para gente conseguir identificar que ia sequência aqui da de aminoácidos a única coisa que a gente tem que fazer é ler a diferença de massa de um pico para o outro porque a diferença de massa

é a massa correspondente e ao aminoácido que foi perdido aqui no pico anterior e aí como a gente sabe aqui a massa unitária né de cada aminoácido a gente consegue aqui Identificar qual é o aminoácido que foi pedido em casa cada pico desse dessa forma a gente consegue montar né gente consegue montar aí um peptídeo um bom então gente da mesma forma que nós podemos separar a proteína descobrir a massa identificar sequência Nós também conseguimos fazer síntese de pequenos aminoácidos pequenos peptídeos a partir da síntese química então a síntese química é muito semelhante com a

cromatografia nem coroa que a gente utiliza a gente utiliza aqui um polímero insolúvel de um reagente químico que vai ficar preso na coluna E aí o aminoácido vai se prender né o primeiro aminoácido desse prender aqui nessa coluna se ligar aí e a polímero E aí dessa forma a gente consegue aí sintetizar um réptil como está feito né então aqui tá o suporte sólido a gente tem aqui Um uma molécula aqui de cloro bom então essa molécula e ela vai se ligar aqui ao a extremidade aqui né carboxiterminal o aminoácido Oi e aí o cara

vai sair vai embora Oi e aí vai começar aqui a 15 repetitivo de ligações peptídicas de um aminoácido no outro então esse grupo efe mal que é um grupo aqui que vai proteger extremidade amino-terminal do aminoácido E aí quando chega o outro o outro aminoácido para promover a ligação peptídica que esse grupo sai para que a ligação ocorra bom então os aminoácidos tem uma o terminal a minha protegido E aí o peptídeo vai sendo sintetizado a partir de ligações peptídicas entre os aminoácidos né então aqui eu vou a ligação peptídica e depois esse grupo sai

vem outra melhor ácido se liga aqui a ligação Petite que vai aí sintetizando uma cadeia e eu psíquica E aí quando eu terminar que esse circo foi aí colocado todos os aminoácidos que a gente quer nossa cadeia o ácido trifluoracético vem aqui e rompe essa ligação o Éster aqui entre o peptídeo e a resina que a gente colocou como suporte para segurar aqui o primeiro aminoácido e ele romper essa ligação e aí o nosso aminoácido o nosso peptídeo nosso de Residente usado aqui sai livre aí na solução é E aí Ah então tá aqui certinha

disse que ia ficar certinha bom então gente nós temos né dentro das milhares proteínas desempenham algum milhares de funções algumas semelhanças sequenciais então proteínas que possuem semelhanças em alguns pontos de sua sequência né sua estrutura primária elas vão ser colocadas em famílias Então temos aí famílias proteínas que são grupo de proteínas que compartilham aí geralmente de 25 por cento de sua de sua sequência e geralmente gente essas proteínas aí essas famílias proteínas elas compartilham também algumas características estruturais e podem compartilhar também algumas características de função algumas características funcionais isso porque nós sabemos que a estrutura

e primária das proteínas afeta diretamente a sua estrutura espacial e consequentemente profundo bom então proteínas que tem sequências semelhante sobre a mente aí terão aí estruturas estruturas espaciais semelhantes e funções é funções semelhantes em algumas famílias e ela vou compartilhar alguns poucos resíduos de aminoácidos só que esses poucos resíduos que as famílias compartilha às vezes não é uma sequência muito grande né de semelhança mas aqueles poucos resíduos aí que vão ser compartilhados entre algumas proteínas elas são são hino ácidos críticos aí Para uma determinada função então nós temos aqui também né proteínas que tem aí

a presença de sequência sinal que são sequências que são e é são responsáveis né Por endereçar as proteínas ao seu local final de onde ela vai desempenhar sua função Então essa sequência sinal aí elas são removidas após da proteína chegar ao seu destino final então aí quando a proteína Acaba de ser sintetizado na minha bolsa como ele ela tem essa sequência sinal que vai ser responsável pelo endereçamento dela então proteína Ela vai para o seu local aí de função a e chegando lá essa sequência final aí é removida né degradada Tem sequência de ligação também

dos sítios prostéticos que são sequências que promovem a ligação de outras outros grupos né como por exemplo glicoproteínas temos as lipoproteínas então esses grupos né os lipídios e tal eles vão se ligar nas proteínas a partir dessas sequências aqui que são sequências de ligação de sítios protegidos temos também as sequências consenso que são sequências que tem partes tão semelhantes mais do que famílias pro técnicas as sequências conceitos são muito semelhantes e elas frequentemente vão representar alguns domínios funcionais que a proteína tem que foram conservados e evolutivamente Então essa sequência de consciência elas vão refletir a

base homem no ácido tem mais frequência que aparece com mais frequência em cada posição então aqui gente faz uma comparação em proteínas diferentes por exemplo e a gente pega aí uma sequência que a gente consegue ver como consequência consenso onde aquele pedaço daquela sequência aquela proteína tem uma base ou tem um aminoácido que e que ele aparece frequentemente aí em todos os todos as comparações né que a gente faz aquela proteína sempre naquela mesma posição ó e isso pode mostrar para gente que esse domínio aí esse pedaço aí da senhora dessa sequência ele foi conservado

evolutivamente não teve variação é nós temos as sequências assinatura que são segmentos né que são iguais só que só indeterminado o grupo taxonômico então grupo de proteínas se tem a sequência assinatura eles pertencem apenas a um determinado grupo taxonômico o e temos as relações evolutivas então gente tudo que nós estudamos a estrutura proteica é e não estrutura né mas cada aminoácido Como se dá essa síntese né proteica o tamanho todas essas comparações e tudo que foi descoberto até agora você conhece consciência né sequência da assinatura e eles podem que podem nos ajudar a elucidar aí

como se deu as relações evolutivas Então a partir do estudo aí das proteínas e das estruturas proteicas as a gente consegue desenvolver aí no estudo é aquele que nos ajudem a elucidar um pouco mais como se deu a evolução aí da vida na Terra e além também né de relações evolutivas a gente consegue fazer várias comparações como por exemplo a transferência gênica horizontal né uma é uma evolução que ocorrem as bactérias quando a bactéria não é resistente ao antibiótico a gente toma ali eu tibiotico matar bactéria E daí um tempo a mesma bactéria a gente

toma antibiótico e a bactéria resistente a antibióticos então isso só relações evolutivas o que aconteceu na bactéria que acontece transferência gênica é quando uma bactéria ela transfere o seu Gene diretamente e para outra bactéria tão evoluindo sim né mas na bactérias uma uma evolução aí de criação de um gene que antes não tinha mas que foi surgiu E aí o gene surgiu na bactéria a bactéria faz a transferência gênica e ela passa e diretamente esse Gene através plasmídeo para outra bactéria para outra esse da evolução das bactérias as bactérias resistentes a antibióticos e a gente

toma bom então eu trouxe esse site aí para vocês darem uma olhadinha é um banco de dados bens e colocam alimentos search Tool é uma ferramenta é um banco de dados de genes e de sequências proteínas então a desses deram tão aí uma forçada né pesquisa em um pouquinho E aí esse site que é um site muito legal e aqui nesse site a gente consegue visualizar todas as sequências as proteínas que já foram descobertas então por exemplo seja está trabalhando como a proteína e a gente purifica proteína depois a gente quer fazer o seu pensamento

dessa proteína desde consegue o sequenciamento dela a gente consegue em pedaços um pedaço né O um sequenciamento parcial e a gente coloca faz a pesquisa que nesse banco de dados e isso essa proteína já tivesse sido Frequency ada Vai estar que esse banco de dados a gente consegue descobrir em todas as características da proteína em questão E aí quando a gente não acha né sequência nenhuma que a gente descobre uma proteína nova faz o sequenciamento dela e o sequenciamento a sequência não tá e disponível a gente descobriu aí uma proteína que ainda não foi sequenciada

e a gente pode adicionar essa proteína e no bom então esse é um site de banco de dados de sequências pro técnicas o e proteínas e desculpa sequências proteínas e sequências de genes Oi gente eu espero que vocês tenham gostado da aula é a terceira vez que eu grave sal ficam já tem um pouco cansada Porque o meu computador eu gravo aula e depois eu entro no programa programa trava e nossa senhora tá difícil mas espero que vocês tenham gostado eu esqueci de falar alguma coisa por favor se vocês tiverem alguma dúvida entre em contato

comigo pelo meu e-mail ou pelo WhatsApp também não tem problema vou ficar feliz em tirar qualquer dúvida que vocês tenham sobre essa sobre as aulas sei que é uma aula difícil né cheia de técnicas não é fácil para mim também eu também estou tenho que estudar bastante né para você desenvolver uma técnica você especialista é uma se você tem que praticar bastante desenvolver sua própria forma né de trabalho é mas espero que vocês tenham gostado e é isso aí até mais e tchau tchau e E aí E aí E aí E aí E aí E

aí E aí E aí