Laboratório em Bioquímica - Eletroforese SDS-PAGE

o Olá esse vídeo nós vamos falar acerca da técnica de eletroforese Mais especificamente sobre o tipo sds-page essa é uma atividade da disciplina de laboratório em bioquímica ministrada pela professora doutora Ana Lúcia sendo realizado em parceria com o laboratório de bioquímica e biologia de proteínas vegetais coordenado pelo professor DrCleverson Diniz e a eletroforese é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas é um determinado gel durante a aplicação da diferença de potencial sendo tipo sds. pe o mais utilizado para análise de proteínas essa técnica pode ser aplicada em diversos Campos tais como bioquímica genética medicina forense e análises clínicas sendo muito utilizada na acompanhamento da expressão e purificação de proteínas além de determinar a massa molecular da proteína essa técnica se baseia na formação e no diferença de potencial no sistema Vale lembrar na e na eletroforese SDS page são utilizados dois 10 um gel que fica na parte superior que é o gel de empilhamento um gel na parte inferior que é objeto de separação e essa diferença de potencial mundial de empilhamento faz que se formem e os cloreto oriundos do tampão de amostra esse seus cloreto correm logo à frente junto com corante também são formados e os glicinato oriundos do tampão de corrida esse sejam formados vão estabelecer a chamada Fronteira de migração as proteínas pequenas vão ser atraídos pelo eo cloreto e todas as outras não se organizar pelo tamanho onde as maiores serão atraídos pelo União dos Renato que fica na parte superior essa organização das proteínas façam que ela sempre em ordem na da mente no gesto de separação essa entrar a coordenada no já de separação nos dá mais confiança acerca da massa molecular medir em relação às proteínas diferentes e para executar meus eletroforese SDS page devemos sim somente preparar um gel utilizando o polímero de politriz a mira a concentração de polícia na mira é o que determina a publicidade do céu o que é um influencia na separação na proteína e esse gel passa por um processo de polimerização devido a reação entre o persulfato de amônio e o te médio que formam radicais livres iniciadores da polimerização da e o outro componente importante é o fds que promove a desnaturação da proteína e também faz com que a proteína fica carregada negativamente dessa forma ocorre uma separação por vez um molecular e para realizar-se uma técnica dois olhos devem ser utilizados os joga separação e o George empilhamento um exemplo de um gel de separação é um gel frouxo a cinco porcento que serve para organizar as proteínas pelo tamanho delas por meio da porosidade do céu e também podemos ter o tampão de corrida que pode ser o Treze glicina de pegar 8. 3 e o tampão de amostra que pode ser o tris-hcl e com ph 6.

8 quando o sistema direta floresce tiver montado coloca-se na tomada e o sistema é alimentado com a corrente elétrica e após a corrida o gel é retirado e colocado em uma solução de coloração que normalmente é utilizado o comércio Igor e depois disso ocorre a despolarização e em seguida é possível visualizar as bandas e proteína estimar o peso molecular da amostra comparando com a proteína padrão agora nós vamos Demonstrar um exemplo de eletroforese unidimensional Primeiramente devemos limpar as placas de vidro com álcool para evitar possíveis manchas [Música] e depois devemos passar vaselina nos espaçadores e E aí o e colocar uma placa sobre a outra e vamos encaixar as placas no modo o ephixa las E aí e se encaixaram módulo na base de montagem e e para verificar a existência de vazamentos a importante testar o sistema com água destilada isso é tá bem antes de utilizar [Música] e depois que o sistema estiver montado é a hora de fazer os dez [Música] e para preparar os primeiros gel devemos utilizar 1. 25 micro litros de 3hcl PH 8. 8 o 4.

16 ML de bis acrilamida [Música] e. . .

98 ml de água destilada E aí E aí [Música] e sem micro litros de SDS um agente desnaturante [Música] e sem micro litros de persulfato de amônio quinze por cento um reagente que deve ser pesado e diluído na hora da utilização o e cinco micro litros de themed para promover a polimerização junto com persulfato agora vamos aplicar o gel preparado no espaço entre os vidros [Música] e após podemos colocar butanol para evitar o contato do oxigênio com gel o que evitaria a polimerização e aguardar que a polimerização ocorra nós podemos então retirar o butanol e sacaram módulo e vamos então preparar o gel de empilhamento utilizando 1. 25 micro litros de 3hcl PH 6.