IMUNOLOGIA - Aula prática ELISA (parte 1)

E aí o Olá luz é nós estamos numa nova aula prática bem imunologia nós hoje vamos estudar a técnica Elisa esse kit que eu vou utilizar nessa vídeo aula de hoje é está relacionado com a determinação de ige Total você sabe que a LG é um anticorpo relacionado principalmente com as alergias né então esse kit Elisa ele vai determinar no soro de uma pessoa é a quantidade de ige Total ou seja não vamos determinar uma G específica nós vamos determinar aí já eu total de G no soro desse indivíduo esse kit é extremamente interessante porque

ele trabalha com 6 controles por quê que são seis controles porque aqui por quê que é controle né porque aqui existe uma de te em uma concentração definida de ige no caso aqui que a gente tá esse controle é o primeiro aqui da tampinha branca O que é o primeiro padrão que eu tô chamando de controle ele não tem jeito não seria um soro uma mostra 100g depois nós temos o controle dois que já tem 10 unidades internacionais por ml o 3 que a 50 e o controle quatro é 100 unidades internacionais por ml o

5 é 400 400 unidades internacionais ó e aqui o seis 800 unidades internacionais por ml é vocês vão entender no final porque que se kit trabalha com concentrações conhecidas de ige certo então são seis concentrações desde aquela que não tem g01 até o cês a sexta concentração aqui que é 800 unidades internacionais por ml é o valor esperado de G no sangue no soro de uma pessoa não alérgica é menos que 150 unidades internacionais por ml certo é o que que eu já fiz é esses primeiros Poços aqui o que vai da letra A até

a letra F nas A1 A2 B1 B2 C1 C2 D1 D2 D3 É e 1 e 2 F1 F2 eu coloquei indo plicata as concentrações tão por exemplo os controles né as amostras que a gente já sabe as concentrações estão aqui a 1 e a2 é o meu primeiro controle aquele que é zero B1 e B2 eu coloquei o controle dois a concentração 10 unidades internacionais por ml sempre duplicada e fui fazendo duplicata até chegar aqui no meu último padrão certo é os que vocês estão vendo aqui de B3 B4 C3 C4 D3 e D4

a z quatro F3 F4 Deixa eu mostrar a placa com mais detalhe que aqui a gente tem uns números né e aqui eu tenho as letras então é que nem batalha na batalha naval certo esses aqui essas duplinhas Aqui já são soros testes soro de paciente choros de indivíduos que a gente vai tentar dosar a quantidade de G no sangue deles tá então que é uma pessoa aqui é outra aqui é outro então sempre testei o soro em duplicado um comentário interessante que quando a gente pensa em Elisa a gente já pensa nessa placa que

já vem com esses 96 Poços ou furos né Essa placa padrão que já vem com a cavidade definida certo esse kit é interessante porque vem como se fosse uma placa e vazia e aqui a gente vai colocando os Pocinhos os furos né as cavidades tá então a gente coloca aqui e aí vai fazendo conforme a quantidade de amostra que eu tenho para trabalhar naquele dia é esse kit na verdade esses Pocinhos né Essas cavidades aqui ela já vieram sensibilizados de fábrica com ige no fundo do poço tão ligado ao fundo desse poço ligado ao fundo

do plástico ali já tem anticorpo monoclonal Na verdade é um anticorpo anti-ige tão indústria já mandou para gente a Quina a gente se fala na fase sólida no fundinho do posto ligado ao plástico Me ligue anti-igg quando coloco soro do paciente quando eu coloquei as minhas amostras elas tingi elas vão se ligar tanto a ige das dos meus controles como as higiene do soro do paciente vamos se ligar com essa anti-g que estava já na fase sólida lá no fundo da cavidade certo essa etapa eu já fiz Vocês estão vendo aqui que tá tudo nesta

coloração vermelha e só que não é um soro não é nos controles tá essa etapa eu já fiz então eu coloquei já aqui as amostras do soro os testes já tinha colocado era um 2020 micro litros + em micro litros do do diluente né então coloquei 120 micro litros de soro testes um desses pacientes assim como coloquei também os controles os controles que tem essa quantidade conhecida de G como eu já falei Nós deixamos encubado isso por 30 minutos a temperatura ambiente lavei a a etapa de lavagem na técnica Elisa extremamente importante já já vou

mostrar para vocês como é que é feita essa lavagem E aí na sequência se você imaginou que eu disse né no fundo do poço tinha no fundo dessa cavidade tinha antes G quando eu coloquei o soro teste ou coloquei os meus controles que tem G essa ige se ligou essa anti-g na sequência agora vai vir uma outra anti-g ligado ligada ao menzinho a peroxidases Então esse é o conjugado só então é é cê tá é exatamente eu estou então a gente colocou nesses Poços tanto para os controles como para as minhas amostras testes eu coloquei

150 micro litros de conjugado esse conjugado O que é é outra anti-g só que agora ligada com enzima peroxidase lembrando né que como no fundo da placa tem uma antes de ou seja um anticorpo que foi produzida produzido contra aí G humana por isso que eu falo anti-g no fundo do poço no fundo da plaquinha coloquei G do soro né Vamos detectar o quanto de jeito Tem um soro desses indivíduos na sequência veio essa anti-g ligada a uma enzima que eu tô chamando de conjugado só nós temos no caso aqui um Elisa tipo o sanduíche

é o Elisa direto Tá eu vou dar uma pausa que agora vou mostrar para vocês como é que a gente lava esses Poços para a gente poder para passar para a próxima etapa a próxima etapa é quando a gente vai colocar dentro de cada qualidade os obstáculos substrato cromogênico bom então acontecendo agora a nossa aula agora vou mostrar para vocês como é que faz a lavagem é é muito importante não ficar nenhum resíduo do último reagente em casa que o conjugado então a gente com muito cuidado a gente joga conteúdo dentro da pia e aqui

eu tenho uma reta com é uma substância que serve para lavar que no caso poderia ser amor este lado tá tendo casa tem pdvs então tão top Então a gente vai preencher cada Pocinho tô tomando cuidado para não fazer muita bolha o Jorge não temos tempo para pia e depois é período a segunda vez nós vamos fazer prometer ser na verdade é que a gente segue a recomendação dos Fabricantes né O que o fabricante fala para gente a quarta vez Lembrando que agora já estamos no teu já a gente já empolgou o soro seus controles

eu já fiz isso uma outra vez que não foi gravar para jantar aí agora a gente depois eu tinha colocado conjugado nós estamos aqui na etapa da hora é eu nunca ver O Expresso conteúdo Oi e aí fabricante recomenda que a gente ficou barulho é mas deixa para não ficar nenhum resido do meu toque no possível certo agora vou continuar falando que nós vamos falar da próxima etapa E então como eu já disse para você agora chegou o momento que eu vou colocar o substrato cromogênico nos postos e é esse aqui é esse aqui que

eu fabricante nos enviou certo então é sem micrômetro é um cacto e Me acompanhe comigo é isso aqui não é tão bonito quanto o outro né Porque a solução e transparente é uma outra recomendação importante é que a gente não pode deixar essa placa e é muito tempo seca Então essas etapas né Depois que lavou quando vai colocar o próximo e a gente tem que ser relativamente rápido a gente não pode deixar esses Pocinhos muito tempo sem ter nenhum líquido no interior deles e aqui do boi né mas não voltar só não pode formar bolha

de dentro aqui né dentro da ponteira e tentar não falar na agulha que formou vou tentar não formar bolha quando a gente vai colocar o líquido dentro dessas cavidades dentro das respostas a pessoa puderem é tá bom tem que ir E aí eu sei que eu pulei e perceba que já vai formando uma cor certo que a gente está no etapa que a gente colocou substrato cromogênico quase perdi a ponteira e agora gente vai e colocar um filme sobre as respostas e segundo fabricante nós vamos aguardar 20 minutos depois eu volto com vocês então para

a gente continuar nossa gravação