Aula #8 - Cinética Enzimática (Parte I)

o Olá pessoal tudo bem nas próximas duas aulas nós vamos falar sobre cinética enzimática um assunto que é bastante importante em bioquímica nós vamos testar a atividade de uma enzima em diferentes condições para verificar a capacidade que ela tem de converter o seu substrato nos respectivos produtos nessas duas aulas todos os experimentos que nós vamos realizar vão consistir de vários tubos e de várias etapas de reações vai ser muito importante vocês acompanhem os protocolos experimentais através do livro didático ou do material disponibilizado pelo seu professor lembre-se sempre de fazer as suas anotações para que a

gente possa interpretar os resultados de maneira mais eficiente vamos começar Então a primeira parte da sala siga no vídeo e boa aula a todos E aí é muito bem pessoal então nessa aí na próxima aula nós vamos analisar a cinética enzimática de uma enzima bastante importante na indústria alimentícia essa enzima chama-se invertase e ela responsável pela Hidrólise da sacarose que o açúcar comum os produtos essa reação são glucose e frutose Livres a inverdade é uma enzima encontrada principalmente em microrganismos como por exemplo as leveduras ela pode realizar a Hidrólise da sacarose numa temperatura média de

25 graus essa enzima também pode ser encontrada com o nome de sacarose ou então com o nome de beta-fructofuranosidase o nome comercial invertase se deve pelo fato da sacarose quando analisada a um equipamento chamado polarímetro desviar o plano da luz polarizada para o lado direito portanto a sacarose é uma molécula chamada destróier Em contrapartida uma solução que tem a mistura de glucose e frutose Livres quando analisados no polarímetro vão desviar a luz polarizada para o lado esquerdo sendo portan e são levogera é o inverso do que acontece uma solução de sacarose a sacarose é um

dissacarídeo não redutor uma vez que os carbonos anoméricos a unidade de glucose e também de frutose estão ligadas através de uma ligação glicosídica portanto não existe multa a rotação nessa molécula já o produto da Hidrólise da sacarose que é realizado pela ação da invertase que vai hidrolisar a ligação glicosídica entre a glicose EA frutose vai gerar monossacarídeos livres ou seja glicose livre e frutose livre esses dois monossacarídeos livres são chamados de redutores a glucose que é uma aldose vai ter o seu carbono anomérico seu carbono um livre e também a frutose que é uma cetose

vai ter o seu carbono 2 que é o seu carbono anomérico livre também esses dois monossacarídeos podem portanto realizar o processo chamado de multa rotação e são como eu já disse chamadas de monossacarídeos redutores os monossacarídeos Livres tanto aldoses como cetoses quando em meio alcalino sofrem um rearranjo e obrigações presentes entre o carbono anomérico e o oxigênio e ambas vieram o mesmo composto chamado de enediol que vai ter uma dupla ligação entre os carbonos 1 e o carbono dois essa característica nos permite quantificar a presença de açúcares redutores de uma solução utilizando a reação do

DNS que é o 35 de nitro salicilato o DNS Nossa forma mais oxidada ou seja com dois grupos nitro na posição três e cinco tem cor amarela e quando colocado na presença de açúcares redutores na forma de Emily ou é reduzido para formar o 3-amino 5 litros salicilato que tem cor laranja escura ou marrom para que essa reação de redução do DNS aconteça é necessário temperatura elevada nessa primeira aula sobre cinética enzimática nós vamos variar dois parâmetros da reação catalisada pela invertase primeiro nós vamos ver qual é a influência da concentração da enzima na conversão

da sacarose em açúcares redutores em seguida nos vamos ver como o tempo de incubação e Flu há uma quebra da sacarose para a formação dos produtos Em ambos os casos nós vamos acompanhar a formação dos açúcares redutores pela reação do DNS utilizando espectrofotometria como eu já falei para vocês Os experimentos que serão realizados nessas duas aulas vão consistir de vários tubos de composições diferentes e serão submetidos a várias etapas de reação e de análise é importante portanto prestar atenção e tomar nota de todas as etapas e dos resultados para que a gente possa analisar os

resultados e interpretar os dados de maneira mais eficiente antes de ir para o nosso primeiro experimento de hoje eu preciso mostrar para vocês a tabela de composição dos tubos de ensaio que nós vamos utilizados então preciso primeiro experimento nós vamos usar seis tubos de ensaio reparem que em todos os tubos nós vamos ter tampão acetato 50 millimolar PH 4 7 todos os tubos não ter um ml dessa solução todos os tubos também vão ter a mesma quantidade de sacarose 0,2 molar é o substrato da nossa em cima repare que a cada um dos tubos nós

vamos ter quantidade de diferentes da solução da enzima invertase no tubo nós não vamos colocar em cima portanto não haverá a conversão da sacarose em açúcares redutores o nosso tubo um portanto será o nosso tubo branco que nós vamos usar para zerar absorbância do espectrofotômetro Quando nós vamos fazer a leitura dos tubos eu separei ainda aqui para completar o volume final de todos os tubos em alguns deles são adicionados quantidades diferentes de água destilada todos os tubos tem que ter volume final de 2,5 ml Então vamos lá para bancada para gente realizar esse primeiro experimento

de variação da concentração da enzima é muito bem pessoal então agora que você já viram Qual que é a composição de cada um dos seis tubos que nós vamos utilizar nesse experimento eu quero mostrar para vocês como é que nós vamos proceder de agora em diante eu tenho aqui dois banhos em temperaturas diferentes esse aqui está na temperatura de 25 graus que a temperatura que nós precisamos para que enzima converta a sacarose os produtos ah e tem aqui um outro banho que está a 100 graus na verdade próximo de 100 graus é a água fervendo

o que a temperatura necessária para que a gente realize a reação do DNS Então nós vamos utilizar essas duas temperaturas para realizar o experimento a primeira para realizar a Hidrólise da sacarose utilizando a enzima sacarase né a invertase e no banho-maria a 100 graus nós vamos fazer a reação do DNS tem que tomar muito cuidado para não se confunde e colocar os tubos na temperatura errada na etapa errada se não Provavelmente eu tô experimento vai dar errado então deixei preparado aqui já pessoal do 6 tubos de ensaio que nós vamos utilizar com todos os componentes

que estavam naquela tabela menos a enzima então aqui nós já colocamos o tampão acetato BH 4,7 já colocamos a sacarose E conforme né nos volumes que estavam na tabela e o que falta a gente colocar agora é a enzima colocar a invertase lembrando que a enzima é sempre a última edição Olá nestes experimentos uma vez que a hora que você coloca em cima a reação começa a se processar então a gente coloca ela sempre por último mais ou menos junto em todos os tubos então no tubo um que o nosso tudo branco não vai nada

de verdade não precisa colocar nada no tubo 2 vai 0,1 ml a 0,1 ML no tubo 2 no tubo 3 vai 0,2 ml as donas em cima e no tubo 4 vai 0,4 ml e no tubo 50, 8 um minuto 61 ml da invertase e eu estou agora todos os tubos estão com a composição completa quem te dá uma ajeitadinha como sempre é homogenizar o que todos esses tubos agora vão ficar incubados a 25 graus por 5 minutos e para que a reação da invertase se processe em algum contar aqui há 5 minutos E aí

é muito bem pessoal passado cinco minutos podemos tirar os nossos tubos da incubação E aí O que nós vamos fazer agora é adicionar 1 ml da solução de DNS do nosso reativo que vai dar a cor que a gente quer ver em cada um dos todos E lembrando que quando a gente adiciona o DNS pelo fato dele está numa solução bastante alcalina vocês imediatamente interrompe a reação enzimática e prontinho a todos os nossos tubos agora tem reativo do DNS e esses tubos agora vão e Como ajudar um pouquinho todos esses tubos agora vão a 100

graus por mais 5 minutos nós vamos colocar os tubos aqui E aí E aí e vamos marcar o tempo oi oi é bom aguardar os cinco minutinhos e depois a gente prossegue em com experimento e o que pessoal passados os 5 minutos de incubação a 100 graus podemos tirar os estudos E aí E aí E aí e como vocês podem ver aqui a cor que fica né o DNS depois que ele é reduzido e pelos açúcares redutores o presente na solução Tá bom o que falta a gente fazer agora é adicionar 6 ml e meio

de água em cada um desses estudos e depois levar para fazer a leitura no espectrofotômetro não vamos adicionar água e prontinho a todos os fios já estão prontos nós vamos esperar mais uns três quatro minutinhos para eles esfriarem e daí a gente já pode a gente levar até o espectrofotômetro para fazer a leitura das absorbâncias e o Ok então vamos lá muito bem pessoal Então aqui estão os tubos onde a gente realizou a variação da concentração da enzima e agora falta a gente fazer a leitura das absorbâncias você já sabem como mexer num equipamento primeira

coisa que tem que ser feita é verificar se o comprimento de onda que está selecionado é o comprimento que pede o protocolo nesse caso a 540 nanômetros Então tá tudo certo ali e a segunda coisa é zerar o equipamento com o tubo branco que é o nosso tubo 1 Oi Tom aa e vamos dizer pra equipamento é que esse tubo tem absorbant igual a zero o ok partir de agora é só fazer a leitura dos demais todos e não esqueçam de anotar os resultados o que você bastante importante para a gente interpretar esses dados aqui

depois o tubo 2 absorbância de 0,25 E aí Olá tudo 31 a absorbância de 0,508 E aí E aí Olá tudo 4 E aí a absorbância é um, zero 22 Olá tudo 5 E aí é um, seis a 20 essa variação na última casa não importa E aí a e por último Turbo 6 a absorbância igual a E aí é um, 766 é muito bem pessoal então esses são os dados a entrar variação da concentração da enzima em frente à os outros parâmetros estáveis na reações enzimáticas da invertase bom então vamos ver como é que

ele tinha interpreta agora esses resultados é muito bem pessoal realizado nosso experimento e determinada a absorbância de cada um estudos nós podemos fazer um gráfico relacionando a concentração da enzima que nós utilizamos em cada um dos tubos com a absorbância que indica a quantidade de açúcares redutores presentes em cada um dos todos como vocês podem observar no gráfico os pontos obtidos para esse seis tubos que nós utilizamos formam um padrão linear ou seja nós podemos traçar uma linha de tendência que vai mostrar que quanto maior a concentração da enzima o maior será a absorbância ou

seja maior será a quantidade de açúcares redutores presentes naquele tubo observa em que nós sempre colocamos a variável do experimento no eixo das abscissas no eixo X e absorbância sempre vai no eixo das ordenadas no eixo Y fica fácil entender essa relação linear uma vez que quanto mais enzimas presentes no meio mais sítios ativos estarão disponíveis para converter o substrato em produto ou seja a realizar a Hidrólise da sacarose quanto mais você aumenta a concentração da enzima + sacarose vai ser quebrada para formar açúcares redutores Considerando o mesmo intervalo de tempo de incubação que foi

de cinco minutos para todos esses todos muito bem pessoal nós vamos direto para o nosso segundo experimento aonde nós vamos realizar a variação do tempo de incubação ou seja agora todos os tubos serão exatamente a mesma composição Mas nós vamos variar o tempo que cada um deles vai ficar encubado a 25 graus antes da gente ir para bancada entretanto deixa eu mostrar pra vocês a tabela de composição dos cinco turnos que nós vamos utilizar percebo Então pessoal que em todos os tubos nós vamos ter um ml de tampão acetato PH 4 7 água destilada todos

eles vão ter a mesma quantidade de sacarose que o nosso substrato e todos eles não têm agora a mesma quantidade da enzima 0,2 ml com exceção novamente do tubo um que vai ser o nosso tubo branco o nosso todo mundo não vai ficar encubado assim como tubo 2 no tubo 2 nós vamos colocar em cima mas imediatamente vamos interromper a reação adicionando o DNS ou seja o nosso tubo 2 vai ser o nosso tubo de tempo de incubação zero o tubo 3 vai ficar incubado por cinco minutos o tubo quatro por 10 minutos YouTube 15

por 15 minutos então vamos lá para bancada para realizar esse experimento o ok pessoal então como vocês viram na tabela para fazer o experimento de variação do tempo de incubação nós vamos precisar de cinco tubos de ensaio e a composição de todos eles é igual como vocês já viram tão todos os cinco já estão aqui preparados exceto pela adição da enzima então eu ainda não coloquei em cima mas todos os componentes estão prontos em cada um dos tubos tão cada um dos todos têm tampão acetato PH 4 7 tem também o substrato sacarose bom e

o que falta a gente adicionar é a invertase todos eles vão ter a mesma quantidade de invertases 0,2 ml reseta o tubo um que vai ser o nosso tubo branco e vamo colocar a inverter as E aí um. a todos eles agora tem a inverdade em dia que nós vamos fazer imediatamente é colocar um ml de DNS no tubo 1 e no tubo 2 então no tubo 1 e no tubo dois Nós já vamos colocar um DNS E aí E lembrando que o tubo 2 vai ser o nosso tubo de tempo de reação igual a

zero minutos e é uma vez que nós adicionamos o DNS a reação já parou de acontecer e o tubo 3 o tubo 4 YouTube cinco vão ficar incubados a 25 graus há um tempo diferentes Então vamos começar a marcar o tempo e o tubo 3 vai ficar incubado por cinco minutos o tubo 4 10 minutos e o tubo 5 15 minutos assim que a gente tirar eles da incubação Nós já vamos adicionar o DNS para interromper a reação enzimática Então vamos aguardar os cinco minutos do tubo 3 e o que pessoal então passados os primeiros

cinco minutos nós vamos tirar o todo três da incubação e já vamos adicionar 1 ml da solução de DNS o que vai interromper a reação E aí Oi anjinho o tubo 4 YouTube cinco ainda vão ficar ali incubadas a 25° o tubo 4 mais 5 minutos total de dez minutos e o tudo cinco mais dez minutos para fechar 15 minutos então aguardar o tempo de cada um deles o ok pessoal então passados 10 minutos vamos tirar o tubo 4 o e adicionar 1 ml de DNS para interromper a reação o ok só falta o nosso

Turbo 5 o que vai ficar mais cinco minutos incubadas bom então vamos aguardar né o ok 15 minutos vamos tirar o tubo cinco podemos parar o cronômetro e vamos colocar DNS no tubo 5 é um ml G1 e interrompendo a reação a é muito bem pessoal então agora para que a reação de detecção dos açúcares redutores né dos produtos da reação da invertase se processe a duração da redução do DNS todos esses tubos vão a 100 graus por cinco minutos vamos lá E aí e vamos botar os cinco minutos aqui ó o e aguardar a

reação do DNS se processar E aí é muito bem cinco minutos a 100 graus nós podemos tirar os estudos E aí E aí bom com vocês percebem acordo todo mudou por causa da redução do DNS o que nós temos que fazer agora é adicionar 6 ml e meio de água em cada um desses estudos para depois fazer a leitura no espectrofotômetro Então vamos adicionar água G1 Oi ok E lembrando que eu estou-vos tem que estar sempre bastante homogêneos né para fazer as leituras de espectrofotometria a corrente agita um pouquinho e depois a gente vai deixar

esfriar o que fazer a leitura no espectrofotômetro E aí G1 o pontinho vamos deixar ele mais uns três quatro minutinhos aqui esfriando e vamos lá para o espectrofotômetro para determinar as absorvâncias de cada um desses todos bom Então aqui estão nossos cinco tubos relativos a o teste de variação de tempo de incubação Lembrando que o nosso tubo um vai ser o nosso tubo branco o tubo 2 o nosso tubo de tempo zero tubo 35 minutos tubo 4 10 minutos e tudo cinco 15 minutos vamos determinar absorbância de cada um deles É mas não sem antes

zerar o equipamento com o tubo branco o Tom vamos ver o verão do equipamento quer dizer que absorbância = 0 o cantinho e sempre lembrar de limpar bem a coberta e vamos ver a absorbância do nosso tubo que corresponde ao tempo zero de reação Lembrando que esse tudo tem essa carazi nela invertase e também tem o substrato só que ele foi interrompido logo em seguida a gente colocou DNS logo em seguida que a gente adicionou a em verdade então absorbância do tubo 2 é 0,040 e essa é a absorbância do nosso tempo zero de reação

e depois de cinco minutos o único bando a 25° nós temos absorbância agora do tubo 3 que vai ser igual a 0,5 22 E aí E aí E aí há 10 minutos de tempo de incubação tubo 4 E aí E aí a 0,9 04 E aí e depois de 15 minutos e da reações enzimáticas a 25 graus celsius e em seguida pela determinação de açúcares redutores pelo método do DNS nós temos absorbância de 1,2 16 para o tubo 5 e o que pessoal então anote os resultados o que nós vamos interpretar esses dados e lá

no quadro É nesse momento Então vamos lá muito bem pessoal então determinada as absorbâncias de cada um dos nossos tubos nós podemos agora fazer uma relação entre o tempo de incubação e a quantidade de açúcares redutores produzidas para cada um desses estudos como vocês podem ver no gráfico os pontos que a gente determinou também formam uma relação linear ou seja quanto mais tempo você deixa a enzima atuando junto ao substrato mais produto vai ser formado ou seja mais açúcares redutores vão ser formados a reação do DNS vai ficar cada vez mais forte percebam que o

nosso tudo dois que tinha tempo de incubação igual a zero na verdade teve poucos segundos da reação da enzima invertase sobre o substrato por isso que ele teve absorbância um pouquinho acima do zero uma vez que nesses poucos segundos em que a reação se processou um pouco de açúcar redutor foi produzido que foi detectado pela ração do DNS Se você deixar um tempo de incubação mais longo para essa reação vai chegar o momento em que o extrato vai ter sido consumido Então vamos supor que a gente deixasse essa reação acontecer por um tempo maior 30

40 60 minutos indeterminado o ponto absorbância seria se estabilizar ou seja não haveria mais produção de açúcares redutores mesmo se você deixasse encubada por mais tempo Porque não haveria mais substrato para ser convertido pela invertase nesses dois experimentos da aula de hoje nós variamos parâmetros da atividade enzimática que afetam a formação dos produtos de forma linear na próxima aula nós vamos variar dois outros parâmetros que afetam de maneira bastante diferente a atividade enzimática também vamos falar sobre a equação de michaelis-menten um sobre a constante de Michaelis menten vamos ver o que que ela significa e

como que a gente pode determinar ela através da variação da concentração do substrato então não deixe de assistir a continuação dessa aula e até lá e E aí