Aula prática sobre eletroforese

o Olá seja muito bem-vindo universo da biologia molecular eu sou Eduardo castanho E hoje nós vamos lá continuidade aula prática de PCR gente na aula passada fez uma pessoa que vocês viram laboratório como é que faz a PCR com um executar todas as dicas valem para você executar da melhor maneira possível a gente vai analisar hoje no vídeo de hoje na aula prática de hoje a gente vai analisar o resultado daquela reação vamos ver se ela funcionou você vai aprender como preparar eletroforese fazer pesagem no estamos ren tudo que você precisa para fazer a transferência

e vamos ver se Nossa reação funcionou dá uma passada Beleza eu vou rodar a vinheta agora enquanto roda a vinheta você se inscreve aí no canal e depois você gostar compartilhe o vídeo dá um like que você ajuda o canal se desenvolver eu vou continuar produzindo vídeo qualidade aqui para você e você vai ter mais informação todo mundo sai ganhando Beleza a gente se vê daqui a pouco depois da vinheta 1 E aí [Música] [Aplausos] [Música] e [Aplausos] [Música] [Aplausos] vamos lá vamos começar nas eletroforese um ver se Nossa reação funcionou a nossa não precisa

aí funcionou nessa aula assim que a gente fez anal de PCR nós vamos é eu vou passar uma parte teórica para vocês depois em volta para prática a diferença que dessa vez aqui nós vamos dividir para alimentar parte teórica em três pais que são vários passeios gente vai fazer então vamos fragmentar essa parte teórica em três pais vão fazer a primeira teórica agora a gente volta uma bancada faço pouco de prática aqui volta para ter o dinheiro prática-teoria-prática e aí a gente finaliza Beleza então vamos lá para o estúdio entender um pouco mais funcionar a

transferência muito bem vamos fases de eletroforese agora um pouco de teoria pra gente ter o contexto aquele que tá fazendo laboratório mas deixa eu falar uma coisa antes de alcance vou começar aqui ter uma aula sobre eletroforese Mauá teórica sobre eletroforese aquilo e vai saber o mal já e eu vou deixar o link dessa aula aqui em cima para você assistir porque porque eu não quero me alongar muito na teoria aqui senão vai ficar um vídeo gigantesco então se você quiser saber em detalhes como é que funciona vai nessa aula teórica que eu tô deixando

aqui em cima é assistir lá mas como que eu vou te passar que você consegue entender também tá bom mas se quiser detalhe vai lá que você vai saber que eu vou passar um pouco mais rápido Beleza então assim como eu fiz lá na aula passada na aula teórica sobre eletroforese eu vou contar a história mas vocês e com o celular futebol com bomba e com Simba lá no Rei Leão você entendendo isso você vai entender eletroforese você entender nessa historinha você vai entender melhor para furar estava um belo dia timão Simba e Pumba passeando

lá pela pela selva lá na África da Vale passeando beleza caminhando usar Azul tava por sempre voando sobrevoando ali observando o passeio deles tomando um conto para ver se as meninas não apareciam é assim Justamente a vista nos azuis que você tá tendo aqui né os três PA e amigos passear na floresta aqui a selva e os azul aqui em cima e observando esse partir deles obtemos agora avisar o pessoal aqui se tivesse às vezes aparecer sem para eles correram depois Justamente que aconteceu em algum momento as meninas apareceram e os Azul gritou lá de

cima timão cima uma corre-campo Siena só atrás de vocês vai para frente que as meninas estão atrás de vocês e os três saíram correndo para escapado assim é por isso que eles fizeram isso acontece injeção ali no meio da selva né Tem galho tem arbusto tem raiz tem planta tem um monte de coisa tem Arvorezinha ali no meio do caminho dele ele tem que passar disso eu disso nessa corrida né as meninas estão desse lado forçando com que os três correram para o lado oposto e eles têm que correr desviando os Argos acontece aqui justamente

por eles terem tamanhos diferentes Eles correm aqui nessa situação nesse lugar que tem resistência a corrida deles em velocidade diferente O Timão é o menorzinho ele vai correr mais rápido ele passa e da árvore do Galho pula a raiz ali ele vai correr mais rápido dos três o Pumba que tem um tamanho intermediário vai correr um pouco mais lento que o timão mais só que ainda mais rápido que um símbolo é grandão e o Simba até o maior só vai ter dificuldade para desviar das plantas as árvores e vai correndo mais devagar Então se a

gente olhar se os três correndo era isso aqui a gente já vê aqui os três começaram a correr o Timão correu mais rápido e depois o Pumba e depois no simba Em algum momento nessa disparada aí os azuis viu que as meninas desistiram de perseguir gritou galera pode parar que as meninas foram embora e quando eles pararam e ficaram me parar no lugar que eles estavam tempinho e o Brasil os Azul viu justamente está sendo timão lá na frente o bomba no meio do caminho e o Simba para trás por quê que isso aconteceu porque

o Timão que era mais rápido menorzinho menor peso e Menor tamanho ele conseguiu dizer mais rápido dos Argos O timão o Pumba no meio do caminho e o Simba mais para trás quero mais então a razão acabou ter uma dificuldade para corrente as árvores e com essa historinha se você não sabe nem eu quero eletroforese você acabou de aprender porque não eletroforese a gente vai fazer exatamente a mesma coisa só que objetivo aqui a gente separar moléculas de acordo com seu peso molecular e não se o timão eô Pumba mas a mesmo racional Nós temos

duas extremidades da selva uma extremidade que é o polo negativo uma extremidade que é o pólo positivo né Os Três Amigos Timão e Pumba eles estão correndo do sentido negativo para o positivo né as hienas estão forçando eles saíram desse lado e correrem para esse lado nós temos uma matriz que causa resistência a corrida das moléculas nós temos uma matriz porosa gelatinosa que causa resistência à movimentação das moléculas nós temos aqui uma selva que causa resistência na corrida dos três amigos nós temos Os Três Amigos cada um o seu tamanho diferente nós temos moléculas cada

um o moleque lá diferente todas juntas perto aqui do polo negativo perto da entrada da da Mata da selfie antes da corrida antes da fuga né Então as moléculas de peso molecular diferente todas juntas aqui próximo da entrada da da selva próximo do pólo negativo e nós temos corrente elétrica forçando essas moléculas a migrare nós temos as hienas forçando os amigos a correrem E aí eles vão correr as moléculas vão correr essa Matriz gelatinosa vai causar a resistência as moléculas de menor peso molecular vão migrar mais rapidamente as despesas de intermediação 1 milhão a velocidade

intermediária e as maiores de maior peso molecular vão migrar mais lentamente portanto se em algum momento a gente desligasse A corrente elétrica nós podemos ver as três moléculas aqui nesse meu exemplo né de peso molecular diferente separado então a tecla que nos permite SUS mas nós temos essa estrutura essa situação aqui e faça o que moléculas de peso da frente mínimo sentido para o outro e por Elas têm uma resistência nesse processo de migração as mais rápidas vão as menores não migrar mais rapidamente do que as maiores e a gente consegue separar as moléculas de

acordo com peso molecular isso aqui eletroforese isso aqui exatamente eletroforese no caso DNA ou do arranhar de ácido nucleico né porque que elas miram por quê que as vão degrada o polo negativo positivo quando a gente coloca a corrente elétrica Porque aqui nós tão vendo as que linha dinucleotideo né 33 esqueminha diferentes lembrem-se Você já viu né os nucleotídeos eles têm um grupo fosfato eo grupo fosfato um dos oxigênio saque do grupo fosfato tem carga negativa Então acho no clipe tem carga negativa e por isso se a gente colocar um RNA um DNA próximo ao

polo negativo já a corrente elétrica polos iguais eles vão se referir a tendência a próximo clico migre para o pólo positivo é por isso que ele migra nesse processo aí ao longo da eletroforese então é uma técnica que permite a separação a molécula do DNA proteína também de acordo com o seu tamanho seu peso molecular só o carro que sua estrutura é isso que a gente está fazendo aqui na eletroforese e quem que é a matriz que causa resistência quem essa Matriz porosa gelatinosa que causa resistência né que faz as vezes da da selva no

nosso no nosso exemplo aqui na aula prática de hoje a gente vai utilizar um gel de agarose é uma gelatina muito parecida com gelatina a gente faz em casa só que ela fez 111 posto aqui especial para o especial eu falar chamada agarose e que é que causa essa Resistência é uma matriz porosa gelatinosa que vai causar resistência no processo de migração EA mostra a gente vai colocar aqui vamos supor que o polo negativo seja desse lado positivo desse nós vamos colocar as amostras dentro dos Pocinhos que a gente faz nessa nesse gel que vai

fazer isso na prática daqui a pouco e gerar corrente elétrica forçando as amostras a migrarem de um lado para o outro separando aí de acordo com peso molecular para que uma outra Oi gente vai fazer lá na prática fazendo esse Joãozinho é bonitinho e a eletroforese acontece um aparato uma Cuba como essa hein digo não dá na prática a gente não vai usar essa exatamente mas é uma estrutura com essa aqui que nos permite colocar o gel que dentro colocar uma solução tampão que vai permitir a geração de corrente elétrica pipetar mostra gerar corrente elétrica

EA o DNA me gravar em Miami grau depois no final da aula prática a gente vai ver a gente vai ter que Enxergar aquele ácido nucleico né que ela aquele fragmento que migrou ali no nosso caso vai ser um produto de PCR né que migrou ali a gente vai ter que visualizá-lo detectar a presença dele a gente vai utilizar poderia ser uma mesa transiluminador a começa aqui não tiver utilizar o equipamento um pouco mais elaborado mas que faz isso gente vai jogar a luz ali fazer o DNA ali dentro brilhar para gente conseguir ver eu

falar isso sobre isso na mais para frente né a gente vai dividir essa parte da hora que em três partes a terceira parte eu mostro mas aqui só para você ver um resultado nenhum resultado a mata Mateus iluminadora esses pontinhos brilhantes aí são as amostras de DNA de RNA que quer que seja um resultado como esse aqui mais ou menos que vai vir um gel só que a foto de um gel então nós temos aqui um olhar só para São várias Pocinhos cada Pocinho vai para uma mostra um olhar para esse bolsinho aqui que nós

temos uma amostra amostra foi colocado aqui e a gente for sou a migração dessa dessa amostra ao longo eletroforese né polo negativo Polo positivo corrente elétrica amostra foi migrando migrando de grama em grama e Grand e a gente parou eletroforese e viu a presença do DNA que jogou fez um de um jeito de visualizar esse DNA que vai colocar uma gente fluorescente nem e vai fazer você DNA brilhar nesse caso que a gente uma molécula som único peso molecular né mas essas outras aqui embaixo a gente pode ver que tinha moléculas aqui de grande peso

molecular moléculas de menor peso molecular aqui embaixo Aqui é um led com barra são vários fragmentos de DNA cada um com tamanho diferente eu tô mostrando aqui no a ver com a gente poderia ver por exemplo cê poderia fazer a detecção de patógenos a gente fez uma pessoa aí para detectar um pacote para saber se ele tava presente ou não é vendo a presença da banda e só que é chamado de banda o DNA concentrado é visível depois no resultado de uma eletroforese é chamado de bandas a banda poderia representar um pacote no por exemplo

né o gente poder estar fazendo um processo de genotipagem e aqui tá vendo o fenótipo de um indivíduo heterozigoto são exemplos de resultados a gente vai ver no nosso caso vai ser algo semelhante a isso daqui né porque a gente até é colocando ali um produto de PCR E pior que a gente tem que amplificar um fragmento só né a ler a nossa PCR tem que gerar um produto só é o que a gente deveria vai ver algo semelhante assim se funcionar não se não funcionar vai ver nada alguns aspectos práticos aqui pra gente continuar

a gente seguir quando as aula prática né primeiro falar um pouco sobre a garota polímero purificado a partir de água bom e é um produto muito utilizado né vem de folga um produto que tirar de aula é muito utilizado em biologia molecular só para você ter uma ideia cerca de cem toneladas de agarose são utilizados por em laboratório é muita coisa então aqui a produção do gel é semelhante fazer uma gelatina que a gente faz em casa algo bem semelhante essa gelatina possui poros e a gente pode controlar o tamanho dos poros a gente pode

deixar uma gelatina menos bem só uma gelatina mais densa uma gelatina mais molenga ou não a gelatina mais dura a gente pode é a basta a gente controlar a quantidade de agarose em relação a solução tampão basta a gente controlar a quantidade de pozinho de gelatina que você coloca em relação a água na sua casa tem uma gelatina mais dura ou mais uma lona né A interessantemente quanto menor quanto mais dura for essa gelatina quanto mais de se ela for menor se não se Pocinhos quanto menor são os Pocinhos mais difícil vai ser a migração

das moléculas maior resistência a gente causa no processo ligação das moléculas o que nos permite no final da é separar fragmentos de tamanhos muito semelhantes né Então conta o menor por cento maior resistência a gente caso na migração dos fragmentos e maior é a resolução mais delicado ao processo gente consegue separar moléculas de peso molecular da muito parecido e o contrário é verdadeiro quanto menos denso fofo o nosso gel maior serão os pó os poros mais facilmente as moléculas migraram menor será a nossa resolução de análise e cada situação de vai selecionar E aí uma

resolução É depende da sua situação vou mostrar aqui daqui a pouco eu tô amostra tô mostrando justamente isso aqui aumente a concentração do gel para aumentar a resolução tão um gel que menos concentrados um João mais concentrada Aqui nós temos poros maiores aqui poros menores E aí você aqui só a porcentagem é para você calcular a porcentagem gel lá numa sala para a gente vai fazer um por cento e se não me engano acho que é um por cento que a gente vai fazer lá e Mas aí você pode trabalhar com gel dois por cento

e meio três quatro porcento meio por cento dependendo da sua é da sua necessidade eu que eu tô mostrando aqui ó se a gente tem um dia um por cento né colocar um por cento de agarose em relação a solução tampão a gente consegue separar fragmento de 408 mil para nos mates é o suficiente para o produto de PCR que eu tenho ali agora se você precisa de um anjinho fraco vai separar fragmentos maiores maior peso molecular faz um gel mais frouxa em gel ou menos concentrado 05 por cento por exemplo separaria de dois mil

a 50 mil para de barras se você precisa de um Jamais Como Sentadão para separar flagrante de menor peso molecular aumentar resolução cinco porcento por exemplo se consegue trabalhar de 10 a 300 separar frango de 10 a 300 pares de bases tanto aqui o mesmo resultado né isso aqui é um líder vou falar sobre lado daqui a pouco mas são vários fragmentos de tamanho conhecido é o que separados aqui por eletroforese em gel de agarose um por cento e dois por cento e três por cento Note que você pegar esses dois aí esses dois essas

duas bandas aqui olha como ela se separaram ela se separaram menos aqui no gel de um por cento quando comparado com de dois por cento outro comparar de três por cento bem separado aqui gente consegue visualizar muito bem aos fragmentos maiores ficam mais difícil separar tem que deixar esse eletroforese rodando mais tempo vai separar aqui também mas aqui a gente conseguiu separar muito bem então não resolvo isso e aqui para finalizar então gente vai falar da solução tampão nós vamos utilizar uma solução tampão e vai ser Iva três coisas ali se resolver na aula prática

para preparar o gel para fazer a corrida depois para banhar o gel mas a solução tão solução iônica que nos permite gerar é corrente elétrica que tem condutividade elétrica né mesmo tampa utilizado para fazer o gel para fazer a corrida para banhar o já depois no durante a todos agir de coloração dele e basicamente utiliza dois tipos de tampão tá em PTBR o Thai que é uma sigla Patrícia ácido acético outros acetato ele te a e tb a atriz ácido bórico Borato em editar o e a para finalizar sua primeira parte teórica aqui então a

corrida na nossa corrida o tampão de corrida a gente vai encher a Cuba vocês vão ver até uns 35 meninos acima do gente vai fazer isso lá na prática e você vai selecionar cê vai trabalhar com tá eu tenho é dependendo de algumas situações né tem essa tabelinha aqui isso olho falar rapidamente vai se fosse dar um print dessa essa tela para você usar como referência aí para você pode utilizar tá e quando né Quais são as vantagens é melhor separação de fragmentos longos ele tem menor capacidade de manutenção do PH ou seja não dá

para fazer corrida muito louco ele vai perdendo a capacidade de tamponar a reação né A corrida é melhor para reutilizarem amostras de se você precisar pegar o produto da eletroforese e fazer uma PCR fazer o sequenciamento com ele é melhor que você utiliza e pai então ele é compatível com reações enzimáticas posteriores as vantagens tende a superaquecimento não dá para deixar ele muito tempo rodando a corrida muito longo acontecendo contar que vai aquecer resolução de DNA e aqui nesses fragmentos o TB é melhor para separação de fragmentos curtos então só para se ter uma ideia

o DNA dupla fita inimiga dez porcento mais lentamente integrado quem Thai do melhor para corridas mais longas sem terminar fosse o único não a capacidade de manutenção do PH é não esquenta tão rápido como o pai e então terminou a tendência de superaquecer a desvantagem o tlm atividade enzimática Então se você for pegar esse produto eletroforese para fazer um sequenciamento uma percebe alguma coisa depois é melhor que você não tivesse TV É mas não tá tá bom e a resolução aqui DNA maior que 5.000 e acima de 1.500 vamos voltar para bancada depois de volta

aqui para teórico então para gente começar entendeu com eletroforese funciona Você viu que ela vai precisar de um tampão vídeo vou utilizar um tampão nesse processo primeiro que ele vai fazer então esse tampão beleza Hoje quem vai fazer um pai você poderia fazer também tbr aí você depende da do que você tá da sua aplicação e teve uma na aula teórica você escolhe o tampo mais adequada hoje vai a gente não faz tanta diferença uma demonstração produto pessoal e tá mais tranquilo então nós vamos primeira coisa fazer a nossa solução tampão essa solução tá que

a gente vai preparar aqui ela vai ter três funções referentes ao longo da eletroforese primeira função nós vamos preparar o gel e com essa solução segundo a função nós vamos utilizar o tampão para tamponar a eletroforese mesmo para poder gerar corrente elétrica EA terceira função depois que já tiver pronto a gente vai banhar esse gel na solução tampão ela já impregnada com o nosso a gente florescente que não saiba eu sei você sabe alguém que a gente vai utilizar aqui tá bom vamos começar a preparar uma solução tampão E você tem algumas opções para fazer

isso você tem duas três maneiras diferentes fazer essa essa solução tanto a primeira delas é comprando os ingredientes heliofilos assim pózinho ali que que compõem o thai e você vai pesar misturar nosso Na quantidade adequada e colocar a água que a gente vai trabalhar com a luta por dessa pra O que é é mais barata mas ela mais trabalhoso também mas você fazendo isso depois que tem que pensar certinho tem que colocar agora o volume certinho depois ajustar o PH para o tampão ficar pronto Nós temos duas outras possibilidades que a outra você comprar um

tampão é já concentrado então que a gente tem a solução tampão o Thai aqui nós temos atrizes GTA já sem vezes concentrada e você simplesmente pega isso aqui de no e na concentração de você precisa ele vai trabalhar concentração de trabalho geralmente era de uma vez né Então essa que ela tá sem vezes você vai diluída de tal maneira que ela fique uma vez só vai pegar um pouquinho isso aqui no celular com água no volume adequado ali para ela ficar uma vez essa segunda possibilidade trabalhar concentração com que a gente pronto já comprado concentrado

e você utiliza no laboratório quando você prepara também com um pózinho com os ingredientes da do Thai O que você pode fazer o que geralmente se faz é preparar ele concentrado você guarde em geladeira guarda lá e depois vai utilizar vai dilui e para utilizar a terceira opção talvez não seja a mais conhecida das pessoas essa daqui nós vamos utilizar e o pai já tem aqui o pozinho time utilizado os ingredientes para preparar o tá já tá aqui dentro de um pãozinho como se fosse e você vai vamos sachezinho de tirar de gelatina alguma coisa

o tipo ele já tá aqui na proporção adequada para você simplesmente misturar água e ele ficar uma vez tá a gente vai utilizar essa daqui que ela é meio que o meio termo vai simplesmente diluir uma solução concentrada Mas vai ter que prezar pózinho também vai pegar lá que tá pronta e mandava rock Então vamos lá que eu vou abrir aqui só para vocês verem como é que ela vem vem um sachezinho mesmo é um sachezinho tá pronto aqui onde tá lá vem com uma blusinha que tá escrito aqui ó vou ler para vocês o

conteúdo desse desse saquinho aqui se dissolvido e 500 ml de água ultra-pura vai ficar na solução Tá aí uma vez com os ingredientes pontinhos para gente Para gente seguir com os próximos passos Deus que ele vai fazer vamos lá vamos começar colocando isso aqui eu vou abrir eu achar aquele que ele abre eu vou colocar dentro de uma de um Helen Maia o cuidado aqui ó tá derrubando um pouquinho você como for fazer faça cuidado não perca o pozinho não porque você precisa ir na concentração de quatro você derrubar um pouco da do componente aqui

você vai alterar a concentração do Thai você não quer sequer uma vez não tô colocando ele aqui vamos ver se a gente consegue dar uma é uma de Luiza nele ele sai aqui da do Funil então coloquei ó todo o conteúdo do pozinho eu já separei aqui a água Ultra pura porque eu fui pegar em outro lugar então já deixei ela aqui preparado os 500 ml não sei o quanto que você tá acostumado a trabalhar com proveta Mas aproveita de todos os instrumentos aqui de medição de volume ao mais é o mais sensível para grandes

volumes né que você pega lá curtir adequado Não esquece de olhar aqui na altura é a barriga ali da solução na justamente um risquinho do volume que você quer aqui já tá tudo certo eu vou colocando vamos ver se eu consigo desfazer essa E aí diz Face e eu tô jogando aqui em cima hoje tal maneira que eu tive todo a nutriz e o edital é o time é utilizado que eu utilizo que eu peguei lá no pauzinho E tu vai com cuidado e se você nesse processo derrubar um pouco de Pi é de pó

fora ou derrubar a água para joga fora com mais de novo porque senão você vai alterar a concentração desse tá aí aqui isso vai interferir lá em todos os outros processos tá bom tem colocar aqui agora a gente tá com ela é maior justamente para poder mexer né tem que fazer aqui eu vou mexer aqui contigo fica aqui não tem filho mexendo até dissolver tudo né Tem que sobretudo não pode ficar sozinho no fundo você vai ver que vai levar um tempinho aqui para você dissolver ele certinho Pode colocar até uma bailarina se quiser colocar

uma para ele para ficar mexendo a gente vai mexer aqui na mão porque eu tô mexendo um pouquinho até dissolver tudo daqui a pouco a gente volta então nosso tá preparado aqui depois eu vou dissolver um pouquinho mais aí levar um tempinho mas já está praticamente Pronto agora a gente vai fazer é preparar o aparato para fazer o gel não tem que preparar que uma estrutura para fazer o chefe cada situação diferente cada equipamento que você utiliza cada publicada para direto Parece que um sujeito em preparar eu tô utilizando uma aqui que é muito prático

é bem fácil utilizar vocês vão ver como é que monta mas não tem muito segredo a gente vai montar ajustar aqui ó me vê lá para mim não ficar torto já não ficar torto ali dentro nem colocar o gel certo não tem muito segredo vamos começar eu vou montar aqui para você só primeiro Aqui nós temos a a bandeja onde vai acontecer onde o gel vai polimerizar ele vai polimerizar aqui nessa PA E por aí vai conseguir escongel aqui dentro certo então a primeira coisa vai fazer aqui nesse meu caso tá os seus vai ter

que ver qual equipamento que você tem mais o racional vai ser o mesmo a gente vai preparar uma gelatina então ele tem que travar aqui ó e esse meu caso primeira coisa que eu encaixo o essa essa bandeja aqui e ele se a gente ajustar aqui você vai ver que esse esse a Paratinga aqui nessa estrutura Onde está recebendo a bandeja ela tem uma borracha que é justamente para não deixar o gel vazar a hora que eu tiver colocando ele aqui ele vai estar Ainda bem líquido né a gente vai colocando ele aqui não vai

deixar ele vazar eu vou ajustar aqui tem que dar uma apertadinha hora que você aperta aqui nesse caso ele vai vai esmagando a bandeja e foi colocou aqui ter quase pronto para a gente jogar um gel tá tem duas coisas para fazer primeira delas nivela encontrar o nível certo porque se você tiver com a bancada torta o que esse aparato torto aqui o gel vai ficar torcendo colocar o gel líquido Aquela aquele polimerizada primeiro essa torta eu vou ter que utilizar esse milhãozinho aqui em cima de dormir então a gente coloca bem ele aqui no

meio ó a e nesse meu caso esse a Pará tinha aqui essa estrutura ele tem a ele tem as rodinhas aqui para ir ajustando o milho eu tenho que ir olhando aquele bem simples Tem que olhar bem de cima e a bolinha a bolinha de ar tem que ficar exatamente dentro do Círculo preto é isso que eu tô fazendo agora tá a bolinha de dentro do Círculo Preto aí tem um outro aqui do lado a gente vai ajustando E aí E aí perfeito agora Bolinha tá exatamente no meio do círculo já tá no meio do

Círculo tá pronto está nivelado a gente vai colocar agora é o pente não posso esquecer de colocar o pente mas vão utilizar essa estrutura aqui nesse negocinho que é ele que vai formar os possuídos Olha gente colocar o jato a gente vai colocar o vão vou mostrar para vocês vou colocar o pezinho aqui acho que o meu tá invertido chover e não tá certinho a gente coloca o print aqui ele encaixa bonitinho a aqui nesse aparato hora que a gente colocar o gel não vai ter George Onde tem um tem os dentes desse frente vou

mostrar aqui de novo para você ó dá uma olhada aqui de perto tem os dentes e esses são esses dentinhos aqui que vou fazer com formar os Pocinhos certo A hora que o gel polimerizar Pois aquele polimeriza gente tira esse pente dali vai ficar buraquinho no lugar do dente certo isso que a gente vai fazer agora não posso esquecer de colocar isso você fizer hoje ar sem esse pente aqui não vai formar Posso sim tô sim beleza então tá pronto o aparato aqui tá prontinha o próximo passo agora a gente preparar o gel vão lá

gente vai pesar agarose vamos pegar o volume certo de solução tampão e depois esquentar polimerizar é e polimerizar ele aqui beleza Vamos a um preparar o jogo lá beleza vamos preparar um sujo agora ó depois que você já tiver mão aí tiver fazendo eletroforese já com com certa frequência e você pode fazer é preparar o gel porque ele vai ficar você vai ver que a gente vai deixar Limpo e tem que leva alguns minutinhos e enquanto ele polymer isso você prepara o aparato né um jeito de você utilizar aqui hoje eu tô precisando frisou a

parado primeiro a gente tempo a gente fazer o chá com cuidado assim já que você pediu de repete Sem problema mas não seu dia a dia você pode otimizar os Amarelo beleza nós vamos fazer a um gel de agarose a um por cento a gente vai misturar uma quantidade x de agora próximo a quantidade de água e tal maneira quem tem um gelzinho 11 por centro algumas coisas aqui para você importante para você saber muito importante primeiro com que a concentração adequada de gel que você vai utilizar o seu experimento depende depende do seu da

sua aplicação Depende a mãe dos seus fragmentos repente algumas coisas certo então a concentração adequada ela vai variados nos seus ferimentos experimento experimento na gente viu Ou vai ver não é que a gente não sei se eu já vou ter falado isso eu vou falar ainda na aula teórica sobre isso tá bom mas você de todo jeito vai ter essa informação para tomar a sua decisão nessa primeira coisa segunda coisa qual é o volume do gel que você e quanto que você vai precisar de agarose que você utilizar toca volume Inicial depende no seu aparato

quanto maior Tem a parte em tudo quanto é tamanho esse aqui eu tô mostrando um pequenininho que ele tem 7cm por 15 centímetros então gente vai fazer 40ml 40 ml de gel certo a gente vai fazer você tiver trabalhando com aparato grande que trabalha com mais à mostra e trabalha com gel em Pocinhos mais profundos você tem que ajustar o volume que você vai preparar do seu gel aí de acordo com sua parado aqui nesse meu caso que eu tô trabalhando que isso é pequenininho só de um grande não tem muita mostra vou no pequenininho

a gente vai fazer ele tem sete pouquinho sentimos eu sei que com 40ml já é o suficiente é o que eu preciso aqui tá bom Outra coisa vai determinar o volume também é quanto que você vai querer utilizar de profundidade exposim ele tem pouquinho que é mais rápido que eu tô sim que é mais profundo se você quiser colocar mais a nossa vai ter que trabalhar com vocês lá então você tem que trabalhar em cima disso também e claro não se esqueça né Para você fazer Pocinhos de tamanhos diferentes profundidades a utilizar itens específicos certo

tô aqui no nosso caso vai trabalhar com esse pequenininho 15 postem precisaria de 15 vai utilizar só alguns a 33 possuímos apenas mas aí no seu caso não seja justa para suas necessidades tá bom Segue aí o protocolo que você tiver em mãos agora seguinte vamos preparar nós vamos fazer um jogar aos 40 ml de agarose a um por cento é isso que a gente precisa aqui por último de PCR ele tem 600 pares de Base a gente não precisa fazer muito concentrada nem muito dia no Então por cento aqui tá tá de bom tamanho

beleza para fazer um por cento 40ml vai ser muito simples a gente vai pegar 04 gramas de agarose 04 gramas de agarose misturar com 40 ml de solução tampão a mesma solução tampão que a gente utilizou na que a gente preparou atrás certo é a mesma é um por cento de Thai ou um por cento e vamos começar aqui pesando eu vou pegar aqui minha balança e vou colocar quanto mais e fala essa for melhor para você tô colocando uma parte tinha aqui para receber amostra não esquece de apertar o botão de tar a balança

senão você vai considerar o peso dela também aqui o certo como sempre foi trabalhar com o Zé não tem mexeu aqui né Você vai trabalhar cambada de precisão o mais adequado você ajustar o nível dela também assim como a gente fez para ajustar o nível do gel você ajusta o nível da balança tem ela essa balança aqui mesmo ela já vem aqui com o medidor de nível que o Justin vai te ajudar da melhor maneira aqui para gente não vou fazer com todos os cuidados no mundo que nós estamos trabalhando aqui não só uma demonstração

né é uma ajustado aqui nela catareira a gente vai fazer pegar agarose e é muito pouquinho aqui no caso a gente vai trabalhar com 04 é muito pouquinho então não vai ficar colher achando você tá pegando todinho não porque é bem pouquinho vou utilizar tô pegando uma quantidade de pequenininha aqui eu vou soltando as Fox 04 Já já chega e aqui já deu 021 Oi Ó coloquei tudo deu quase 003 aqui no meu colocar mais um pouquinho cuidado para não passar você passar tiro tá E aí Tu tá indo quase quanto mais precisão você necessitar

o mais adequado deve ser essa pesagem que você tá fazendo aqui certo mais adequadro a gente quer fazer um por cento mas é que é uma demonstração é um produto de PCR gente vai analisar a gente tiver um um pouquinho mais concentrado porque eu coloquei um pouquinho menos de solução um pouquinho mais agarose ou um pouquinho mais de Luiza já não vai ser um grande problema aqui que é só uma visualização é uma confirmação de um produto percebe a você já fazer algo que demanda mais resolução aí a pesagem tem que ser exato aqui do

agarose tá aí p04 e vai colocar os 40 ml de solução aqui nosso caso não estão fazendo exato mas arrancou Aquela aquele medo do que não funcionar agora essa pesada tá quantidade certinho aqui vamos voltar para cá e pega um Helen Maia tem um animal era aí no meu caso eu vou fazer 40 eu peguei um ele é mais um pouco maior só entender porque já já eu vou fazer isso é maior e mais fácil do mexer de misturar aqui mas eu vou dar uma dica boa para vocês daqui a pouco pegou ela é Maia

Coloca aí com cuidado a solução ele Oi de novo né se você deixar cair caiu fora do Helen Maia perdeu um pouco da da sua garoze para e começa de novo preciso estar perdendo a concentração aqui nessa não tá trabalhando concentração certa é uma dica para quem tá trabalhando com preparando um gel na concentração específica eu como que agarose aqui vai ficar um pouquinho nós não talvez não deu nem para chegar no vídeo quebrou mas fica um pouquinho do pó aqui grudado nesse nesse plastiquinho né nesse negocinho aqui que você pode fazer na hora que

você for jogar solução joga a solução no volume é quadro Claro lavando aqui tirando toda agarose da desse esse meu recipiente Fechou então beleza deixa agarose aqui do lado vamos colocar o volume certo trabalhar com proveta de novo nós vamos colocar 40ml show vestida de no YouTube agora de no meio tudo e não tem mais nada Vamos colocar 40ml e lembrando não é sempre faça isso no nível aqui da e do seu olho para você colocar o volume a de 4 a beleza 40ml excelente guarda aqui se a sua solução que a gente vai utilizar

de novo voltamos aqui vagarosa ou se você quisesse passar aqui lavando poderia tá para tirar todo o restinho de agarose ali ficar o peso certinho ali na bandas como eu tinha colocado um pouquinho mais nem vou fazer essa lavagem e coloca a a solução aí o Taiyo tampando a concentração adequada e aqui você já pode começar a misturar não vale não vai mostrar que ele só vai misturar mesmo em alta temperatura né você não vai conseguir fazer uma solução aqui muito longe ele vai ficar esbranquiçado como você tá vendo tudo bem porque em alta temperatura

a gente resolve esse problema daqui a pouco tá uma dica para você duas dicas agora nesse momento você e tá aí trabalhando no laboratório situação de verdade para de precisão alta resolução seu gel você não vai no caso de fazer um gel de 40ml com um gel pequeno começo que eu tô fazendo vai fazer o seu gel não é lembrar desse tamanho que eu tô fazendo que não vai fazer um menor você pega você até Pode preparar a sua solução em recipientes maiores mas o certo você fazer o seu gel lá no ela é pequenininho

porque estamos porque você fazer isso que vocês vão ver que no próximo passo a gente vai levar isso aqui para o microondas é a temperatura de ebulição mês que vai entrar em ebulição para para agarose misturar com a solução tampão e a gente polimerizar o sal depois deixar informado Gelatina é um esquema de latinha ainda fazendo aqui né Igual a gelatina do Bocão é isso está fazendo É a mesma coisa misturou negócio aqui com uma solução com água quente e vai deixar esperando para vir a Gelatina é isso que está fazendo não tem diferença só

quando você coloca esse seu hellenmar lá no micro-ondas a gente vai fazer esquentar ela ele lá no micro-ondas que que vai acontecer a a solução que tá aqui dentro água que apresente na sua solução tá ela vai evaporar naturalmente ela vai evaporar e se é levar para você Concentra o seu gel que você não quer consenso geral no processo de preparação dele você não quer então duas dicas a primeira delas trabalha com ele e Mayer pequeno porque quando você trabalha com ela em maior pequeno a evaporação ela vai acontecer mas ele o fato tem uma

boca menor vai segurar a água aqui dentro vai com vai com evaporar mas ele vai segurar aqui vai evaporar bem menos o que evapora se você tiver trabalhando com grande como eu vou trabalhar certo a dica que eu dou para vocês é você pegar uma caneta pega uma caneta a deixa ele aqui paradinha né espera ele parar de se mexer pega uma caneta de marcar tubo mesmo e faz um risquinho aqui exatamente onde está o seu gel por quê Porque sim evaporar vai diminuir o volume e você vai ver que vapor o aí que que

você faz simplesmente coloco um pouco mais de solução tampão para chegar no volume a de quatro eu vou pegar aqui é a caneta vamos fazer essa marcação Zinha em fazer a marcação depois você lá vai eh copo na altura do olho também não esquece fazer na altura do olho para você não não perder tô fazendo só um risquinho aqui para ficar fácil de lavar também sem sair deste volume se alterar o volume eu vou saber que alterou o volume E aí eu coloco uma solução tampão agora a gente vai levar isso aqui para o micro-ondas

para derreter para homogenizar essa solução e depois a gente polimeriza embaixo a temperatura vamos lá beleza então estamos com tudo pronto aqui vou colocar no microondas que que você vai fazer você vai o tempo aí no micro-ondas um lá depende do tamanho do gel para você dois minutos cinco minutos um minuto depende o tamanho do gel esse aqui por esse volume que eu tenho um minuto e bem vai ser insuficiente certo E hoje vai fazer para pegar esse papel você vai entender porque vou colocar aqui no microondas não tem erro coloca lá no meio vou

deixar aqui um minuto e-mail e deixa rodando vai rodar aí deixa rodando por 30 segundos hora que der 30 segundos você para a gente vai parar eu vou pausar ele fazer uma organização é que dá uma organizada ali aí eu volto para lá deixa mais tem que ser muito fácil mais uma organização e volta e assim por diante tá eu dar ele já vai dar aqui os trinta segundos que você vai fazer com cuidado Oi como vai está muito quente chupar ele aqui já como vai Tá muito quente aqui eu recomendo que você faça levantar

aqui pra vocês ver pega um papelzinho papel toalha mesmo faz um rolinho aqui você vai usar ali com suporte para pegar Como suporte para pegar ela é Maia tá aqui ele já tá ficando quente ainda não está muito quente não tá consigo pegar ele com a mão ainda ele não tá muito quente o meu papel ficou muito pequeno eu vou deixar ele é maiorzinho um pouco a Ah tá aqui ó o e homogeniza tá bom que meu caso que não tá muito quente ainda eu vou até homogenizar ali Com mais vigor e porquê e olha

eu consigo tirar toda a solução tá um pouco de a garota que tava na parede tá pode só que ele tá esbranquiçada ainda então tá longe de tá pronto tá E aí você volta para lá mas 30 segundos deixa 30 segundos agora uma coisa importante ele vai começar a esquentar de verdade agora vai ficando temperatura bem alta você tem que tomar cuidado com o abuso a parede do Helen Mayer ela vai esquentar mais rapidamente que a própria solução quem tá ali dentro eu próprio que a própria agarose Então quando você tirar se você tiver com

as agarose perto do ponto de ebulição que é o que a gente quer quando tiver perto de um ponto de ebulição e você tirar essa essa ela e Magali e misturar agrorose hora que agarose entre em contato com a parede do Alemão aqui tá muito quente agarose e atribuição ela era a temperatura que ela precisava era que lhe restou de temperatura que ela precisava para entrar em ebulição e se ela entrega iniciam após espirrar então muito cuidado a hora que tiver ar quente você abra o microondas Eu recomendo que você pega o seu papel e

lá dentro do micro-ondas vou fazer aqui em fora para você conseguir ver mas lá dentro do micro você dá uma viradinha a boca dela é mais virado para dentro do microondas para você fazer essa essa mistura aqui é que aqui um Alemanha que tá com grande uma solução ela tá e pouco volume Mas se você tiver com muito volume e tiver muito quente ela pode espirrar espirrar no seu rosto então viram lá para dentro faz aí com bastante cuidados antes de eu levantar que vocês conseguirem chegar Ah tá bom ela tá começando já para mim

já que já estaria bom qual que é o ponto aqui vou aniversário tá bom não pode ter e não portas branquiçado eu não pode ver nenhum grânulo de agarose certo aqui para mim já estaria de bom tamanho Eu acho que eu nem vou eu nem vou esquentar mais vou deixar mais um pouquinho vai vou deixar mais 30 segundos Só Por garantia há 30 segundos aí depois que terminar aqui uns 30 segundos tivesse realmente homogêneo um solução do jeito que você queria você tem duas opções ou Pega até umas opções aí nas duas principais viu você

pega esse seu gel deixa uma bancada esfriando vai levar alguns bons minutos para esfriar tem que chegar em mais ou menos a 60 graus Celsius ou você pode acelerar o processo de polimerização você pega assim esse seu Joãozinho aqui tá quente para caramba ainda leva uma torneira separar leva a uma torneira e você vai esfriando e ele com água gelada é por fora jogando água por vamos fazer isso para vocês verem tá aí você acelera o processo beleza aí eu vou dar uma dica aí que a dica que todo mundo todo mundo você vai aprender

lá que eu faço um laboratório todo mundo vai chegar essa dica tá então ver se ele ficou bom aqui se ficou E aí é um Que belezinha é uma solução bonita aí acho que agora a gente pode me acelerar o processo de resfriamento dele na água só para vocês ver E aí tá pronto para gente polimerizar vamos lá então tá aqui ó vamos se deixasse na bancada resfriando a resfriar algum momento ele vai começar a polimerizar nessa não pode deixar de polímeros Às vezes aqui dentro senão ele vai ficar ser um gel que dentro né

que você quer mas você pode acelerar o processo só jogando água por isso vai resfriar um dele aqui e como essa aqui é um jogo de volumes pedirem rapidinho ele esfria a mas quanto que você vai deixar esfriando a qual é o ponto certo tem um temperatura certinha que facinho de você eu tenho nar é o seguinte esfriou um pouco encosta aqui ou o vidro na sua mão e a pergunta que você vai se fazer a seguinte eu daria uma mamadeira com essa temperatura um bebê tomar não tá clarinho aqui tá muito quente e se

o bebê tomar essa madeira aqui nas temperaturas vai queimar então deixa esperando mais um pouco e deixa esfriando aqui cuidado né para você não se queimar que ainda tá bem quente aqui e para dar uma olhada aqui tá quente será que que eu daria uma madeira se temperatura ainda tá meio quente tá que tá chegando Já mas ainda tá meio quente é uma acho que agora vai chegar chegou a temperatura boa agora horas agora tá tá bom vamos levar lá para prato nós vamos jogar o agarose ali dentro agora para o já polimerizar formando um

gelzinho quadros com as os passinhos do jeito que a gente precisa certo de uma beleza temperatura certa agora não pode demorar muito que ele vai começar a polimerizar não tem muito segredo nesse momento aqui vai despejar a agarose aqui no aparato que você preparou é uma coisa importante porque a gente chegou nas temperatura mesmo joguei ele quente aqui dentro porque você pode entortar o aparato ele pode entortar mesmo esse negócio aqui de plástico sei lá que eles vão até umas ele entorta EA temperatura e ele vai me estragando Conforme você utiliza ele muito quente você

jogar solução que a internet Então chegou a temperatura aqui ideal não ele tem muito segredo que você vai jogar com cuidado e evitando o máximo possível de fazer bolha e também jogando a solução E se fizer bolha depois você pega uma ponteirinha história ela e vai jogando com cuidado e já tá polimerizando e eu demorei aqui falando com vocês ele começou a poli lá mas tá Deus deu certo agora você vai olhar aqui dentro para ver se não tem bolha e se tiver bolha a tem uma bolha você não quer molelense tiver bolha Não vai

atrapalhar o processo de migração DNA tiver você pega uma ponteirinha faz tudo com luva tá tudo que você tá fazendo o que tem que vem vai estourando agora se ela aparecer ali se você não conseguir estourar Empurra a bola para o cantinho do do aparato vai bem para contando já porque ele não vai ter problema certo ou história amônia ou não faz bom aqui acho que não teve nenhuma ou não faz bolha ou Você fura bolha história ela ou você Empurra Lá para o cantinho do aparato E aí tá tudo certo Agora é só esperar

polimerizar rapidinho aqui já deve estar mais 15 mil você vai estar polimerizado que eu já tava bem geladinho E aí tá pronto para gente se ver o próximo passo então enquanto o nosso gel que ele vai polimerizando vai solidificando que a gente vai fazer é um lá para o outro lá para o estúdio eu vou mostrar para vocês vão falar um pouco sobre o Leather S marcador de peso molecular que a gente vai utilizar e o tampão de carregamento que também é muito importante agora nessa etapa o entender como eles funcionam E aí o já

vai estar por e a gente volta aqui ipe e faz apertar gente vai começar apertar a mostrando já beleza vamos lá voltamos aqui para teoria agora mais rapidamente do que a primeira parte né porque aqui é mais tranquilo então primeira coisa que eu quero falar pra vocês é um padrão para que serve o padrão Ou lebre quem que utiliza ali na reação Para que serve né você pega uma mostra como essa que correu na eletroforese fragment in aqui correu bonitinho você quiser saber o peso molecular dele dá para saber só olhando aqui para ele avulso

não dá para saber o peso do mundo Claro ele não sei se tem 2000 3000 5000 para debaixo 200 pode mandar para saber mas se nós te correremos um coelho e uma referência um ler um padrão de peso molecular conhecido uma mostra que contém vários fragmentos de DNA de peso molecular conhecido ele a gente pode usar só que como referência né então por exemplo se a gente soubesse que esse meu padrão aqui e se fragmente vai ser lá então eu vou juntar aqui no valor 3000 pares de bases esse nosso fragmento e também tem por

volta de três mil tá mais ou menos a mesma altura migraram mais ou menos a mesma velocidade né trouxe aqui eu levo eles servem como referência tá então é isso aqui que eu tô mostrando uma fotinho mais bonita aqui de um ele tem inveja de tudo quanto é peso molecular com diferentes fragmentos quantidade de fragmento resolução tamanho de fragmento que você consegue separar TendTudo no mercado aí então padrão também chamado com glitter ou marcador de peso molecular é uma amostra de DNA ou RNA weather pode ser de nenhum RNA e fragmentos conhecidos e de vários

tamanhos né então aqui tá mostrando justamente isso é um fragmento aqui tava tudo misturado depois Eletrobras ele separou desse jeito eu sei que esse primeiro fragmento aqui é o maior vão 10.000 para de base e segundo ac8000 terceiro 6100 por Gente alguém foi lá pegou o fragmento de DNA de diferentes tamanhos e preços molécula conhecida misturou tudo num tubo no Leda e ele separa dessa maneira ao longo da eletroforese servindo como referência ele aqui do lado separando é bonitinho aí para gente seguir finalizar essa segunda parte teórica fala sobre o tampão de carregamento a gente

vai misturar a mostra um tampão de carregamento quem tem várias funções tampa de carregamento ele é fundamental muito importante eu falei para vocês nessa nessa PCR nesse kit de pessoal é quem já utilizou na aula passada ele já vem com tampão de carregamento não precisa ler misturar a gente misturou aqui eu explico lá na aula prática né gente mistura aqui só para você ver como funciona né para simular o que você provavelmente Faria aí na vida real no seu laboratório então você pega a mostra mistura essa moto com um tampão de carregamento ele tem várias

funções ele tem a função de carregar a amostra para o fundo do postinho né porque você vai apertar mostra que está em um gel banhado numa solução já fica imersa numa solução a solução tampão que vai gerar corrente elétrica em interpretar a nossa ali dentro se você não tem nada é que carrega essa mostra para o fundo do postinho do gel a hora que você perto ali de uma solução a dispersa né então assim e as principais funções da solução do tampão de carregamento eu somente carregar amostra para o fundo do poço em a geralmente

essa mostra o tampo é feito de glicerol ou sacarose é o que tá mostrando esse vídeo aqui né ele vai fazer isso lá mas aqui tá facinho de ver ó tem amostra misturada com um tampão de carregamento que é esse negócio roxo ou verde ali do lado né A gente consegue ver a mostra indo direto para o fundo do Pocinho sem dispersar tá bom ela tem a função de distribuir amostra no postinho também né para ficar bem homogênea dentro do Pocinho tem a função de fazer a manutenção do PH e força iônica da amostra ao

longo da migração tenho que a gente consegue visualizar né a gente além disso a gente consegue visualizar esse tampão de carregamento migrando ao longo da eletroforese que o DNA ou RNA a mostra que a gente consegue ver ela tá invisível no encontro gente não corta elas continuem vindo consegue ver máximo tampão de carregamento gente consegue consegue ver imigrando ao longo de eletroporação uma rede e para a gente saber a hora de parar a corrida né ele também review a degradação do ácido nucleico porque ele pode conter deter né que é um quelante de magnésio evita

a degradação aí por enzimas é tão falei a migração visível da corrida representa por cento do volume e só tem que tomar cuidado que ele possa esconder a banda porque ele tem um tem um peso molecular também então tem que saber escolher para ver se o seu tampão de carregamento não vai sobrepor com com a banda tem considerar isso também tá bom vou encostar a gente finaliza essa segunda parte vamos voltar para bancada a gente volta aqui para finalizar terceira parte teórica Beleza entendeu mas funciona Leather mas funciona tampão agora que vai fazer pegar o

gel que tá aqui ainda nosso aparato passar para cá jogar solução tampão que vai permitir a troca iônica aqui a fazer a corrente elétrica E aí vamos pintar a moto preparar a mostra Taí misturar a nossa que você pode carregamento e apertar aqui dentro uma coisa que eu não falei lá atrás mas uma boa dica que eu lembrei aqui agora se você tiver utilizando uma parada aí pela primeira vez tá em e faz a gente montou aqui os Peixinhos Jão né certo se tivesse vazando é perder tudo que o gel para ele tudo que eu

tinha feito já se você pode fazer jogar água é isso aqui de água vê se não tá vazando se vai pingando tá tudo certo joga fora água aí você vem coloca o seu o seu João tá bom mas agora tá feito que nós vamos fazer eu vou tirar ele daqui para ficar mais fácil visualizar o certo seria fazer com ele aqui dentro só por garantia para ter certeza que que nada ia sair do lugar mas para ficar fácil de ver na câmera vou tirar ele aqui estou soltar ele E aí e a gente não vai

usar mais agora vou colocar aqui desse lado já estão ali de novo né Poderia ter feito tudo ali dentro para garantir que não ia sujar nada né contaminá-la nós aqui na nossa demonstração tá aqui ó que eu vou fazer agora é tirar esse dente mas não tirar o pente aqui para formar os potinhos aqui é um processo tem que fazer com cuidado se você tirar esse pente ele meio torto tirar inclinando ele entortando para o lado você vai rasgar os passinhos que você acabou de formar que você tem que tirar ele para cima Bem para

cima na vertical mesmo com cuidado devagar para você me destruir os passinhos Tá bom então ele vai fazer isso agora eu vou fazer vou te baixar aqui para fazer com cuidado devagarzinho e segura aí o seu aparato né ali se tivesse a empresa você bem mais fácil mas aqui ó eu vou te esperar aqui para câmera pegar vou subir aqui devagarzinho na vertical vai puxando sou tão pronto tá importante você não fazer isso para lá para cá sim pro lado para não destruir o Pocinho eu te mostrar como é que ficou e aqui vai ser

meio difícil de ver por causa da Luz você colocar esse negócio preto aqui não sei se dá para ver na câmera Ah mas ali tem uns passinhos formados algodão uma geladinha aqui para você ver tá formou os passinhos bonitinhos a espessura do nosso já como é que ficou aqui ó tô vendo a um jejum bem consistência você menos de um por cento ele está mais delicadinho beleza já está aqui me pegar a nossa a cuba a gente vai fazer eletroforese se e vai colocar a bandeja ali com gel não tem muito segredo Na verdade uma

coisa muito importante os potinhos estão limpos próximos a uma extremidade hoje aqui nesse caso se poderia fazer todas as rodadas Pocinhos também né a gente fez uma sofre de colocou o pente enfim eu poderia ter colocado o presente em cima e um pouquinho para baixo do Meio você consegue Aqui são 15 possa trabalharia com 30 mostra de uma vez 30 corrida de uma vez tá mas é que a gente fez só um que não preciso os passinhos estava falando essa paciência eles estão aqui próximo à extremidade um gel o Pocinho ele sempre tem que estar

mais próximo do polo negativo do que do Polo positivo aqui é o polo negativo aqui é o pólo positivo O preto pode positiva vermelho porque o DNA o RNA e vai migrar do negativo para o positivo se você colocar o contrário ele vai me dar o só as famosas o mangá por outro lado caiu já acabou perdeu tô sem colocar os potinhos sempre perto do negativo Tá bom então jantar aqui perto negativo vamos pegar a nossa solução um time que a gente fez lá uma vez a mesma função que a gente fez lá no começo

não é do vídeo e começar a despejar aqui joga aqui na sua Cuba vai enxendo lá enchendo Enche Enche Enche Enche até passar um pouco do gel passou um pouco vem aqui para outro lado era tudo comunicado né mas estou colocando aqui de uma maneira mais homogênea tá enchendo quanto que você vai encher você vai encher até até a sua solução passar um pouco a altura do gel vamos ver aqui ó aqui no meu ainda tá longe ela tá abaixo já tá eu vou continuar colocando e deixa aí ó os volumes EA se ajeitar vai

colocando deixa passar alguns poucos milímetros da altura do gel vamos continuar enchendo aqui ó ó cobrir o gel tá com alguns a alguns poucos milímetros acima da altura do chão certo é isso que eu quero pronto só que é o suficiente deixa eu ver se a solução ele se assentou aqui belezinha o gel tá em março ali que bonitinho tá aqui agora que nós vamos fazer é colocar a nossa aqui dentro só que nos colocar a mostra não tem que preparar misturar amostra com um tampão de carregamento e a gente vai fazer a nossa reação

de PCR que a gente fez na aula passada eu peguei e ali cortei eu peguei em um dos tubos amostra um eu peguei um micrômetro da morte não dá mostra um eu peguei dois mil litros e da amostra 2 peguei microlita invertido tá pra gente colocar aqui para ver como que vai não vai ter diferença desse microlitro para o outro nesse caso nesse caso aqui o nosso tampão de carregamento tampão de carregamento ele tá concentrado seis vezes ele tá seis vezes concentrado Então a gente vai colocar nesses dois micro litros de amostra mais ou menos

4000 micro litros do tampão de carregamento para ele ficar uma vez não precisa ser muito exato aqui não não sei não pode colocar pouco né por isso não amor você vai flutuar na água e vai ser vai se dispersar Mas eu acredito para a mostra onde vai colocar uns quatro micro-ônibus das o pagamento e na mostra 25 né colocar um micro liga mais para ficar na mesma no mesmo valor a gente vai fazer agora vou pegar só que eu tô com medo dele cair eu vou abrir esse negócio aqui é colorido para caramba se cai

vai fazer uma sujeira desgraçada estão lá a mostra um que tem dois micro litros já lhe contei é a nossa dois com microlitro tô aqui para mostram Vamos colocar quatro chover essa daqui não essa daqui e já tem quatro aqui um abrir esse negócio que eu falei ele é bem colorido não é que é capaz de sujar o tubinho é normal tá suja um pouco a parede Não se preocupa muito com isso não então esse aqui quatro um colocar o tô olhando aqui ó eu tô o melhor aqui nesse caso seria licota explicar um pouco

meio esquisito né a loja bem coloridão tá vendo ele tem uma gota a mais que mais aqui não tem tanta importância eu ver que ele vai fazer um borrão lá no João e como organizei aqui só para ficar bem homogêneo usado com a mostra mesmo G1 e eu vou colocar 5 e a outra mostra colocar um pouquinho mais a amostra 2 E aí e olha eu fico um pouco na e ele fica aí vai sujar o tubo tá ele vai sujar que a ponta da ponteira não tem problema feito muito bom agora o nosso Líder

tá aqui ele já tá pronto lá misturadinha nele ele já esse lado especificamente aqui ele já vem pronto para do carregamento ele já vem misturado com a solução de carregamento alega que não você tem que pegar lá deitado ali como se fosse uma nossa misturar com solução de carregamento e mas nesse caso aqui não não preciso que o lado já do bem Pronto a coisa importante eu esqueci de falar lá na aula de PCR bem importante na verdade Olha aonde PCR a gente usou aquele tampão aquele mastermix que já vinha com um tampão de carregamento

que vieram direto colocar na na eletroforese que eu falei para vocês porque eu tô colocando teu pão de carregamento aqui eu só tô colocando um tampão de carregamento aqui para mostrar para vocês só por isso eu digo em bem à mostra e coloquei o tampão de carregamento para mostrar para vocês se a gente você tivesse utilizando o máximo que a gente utilizou e na áudio pessoa de PCR Você poderia colocar Ele diretamente aqui no geral não precisaria fazer nada isso que eu tô fazendo agora assistindo gente colocar lá no Gel como eu quero mostrar para

vocês que muitas muitos de vocês vão ter que fazer isso então eu peguei a eu peguei a solução de ao tampão de carregamento misturei com amostra e coloquei aqui para simular o máximo possível que seria a vida real de vocês Beleza então é isso daí eu vou colocar amostra agora que tá aqui tem que tomar um certo cuidado e com a gente olha quando você olha aqui o de cima é bem difícil de ver o os passos já bem difícil se olha aqui sem saber meu Deus do céu eu vou colocar a mostra ali Sai

daí Pânico e você principalmente se você tiver um fundo claro então uma dica é você colocar um papel escuro embaixo e papel escuro embaixo da sua curva aí fica bem mais fácil de ver fica bem mais fácil de ver e ouvir essa aqui que vai ficar melhor ainda aí nossa aí ficar facinho de visualizar certo é e vai colocar mostre Qual que é o segredo de colocar a moto tem que interpretar aqui com cuidado você tem que ver em com cuidado vem com a mostra coloca lá no postinho e solta o líquido com cuidado lá

no fundo do Pocinho né você não quer dispersar mostra não tem que pensar um pouquinho os apertando aqui tudo bem não quero expressar muito eu ver com a ponta ele cuidado vai lá no fundo que perto cuidado acho que você tem que ter é não ir com a ponteira lá no fundão mesmo até o ponto de você encostar no já porque você pode furar o gel e vazar né vazar sua mostro pro Cuidado para você não furar o gel a gente tem aqui por volta vocês micro litros vou pegar então ajusta isso aqui para 6:00

legal sempre trabalhar mais ou menos um volume que você vai completar mesmo para não entrar aqui na ponteira então lá vamos começar e com a mostra um eu vou colocar ali mais ou menos no meio do o tempo ajustar o volume que tava com um pouquinho mais ai que isso aqui tava com um pouquinho mais volume isso Ah beleza eu vou apertar tá vendo que sobrou sobrou tá com ar aqui na ponta da ponteira tava um pouquinho de ar então eu vou fazer apertar aqui um pouquinho com cuidado para chegar à solução bem próximo da

ponta para mim injetar ali no João não seria muito problema injetar Mas eu tenho medo de pressão com a mostra tá ó essa que eu vou fazer aqui de longe depois vocês podem ver eu vou trazer a câmera mais perto para vocês ver eu vou aqui bem de cima óleo Pocinho de cima se encaixa lá dentro Cuidado para não furar a Qboa amostra um foi vamos que eu vou trazer a câmera aqui mais perto para vocês verem para mostra dois e e depois a gente tem o lado aí também tá bom aí que vocês vão

conseguir enxergar o Pocinho com mais com mais clareza deixa eu ver qual que foi essa aqui já foi lá fora a amostra 2 é só Sobrou um pouquinho aqui tem ar na ponta da pontemac tem pouco vou colocar lá do lado aqui mas não exatamente colado tá quem não sabe um tampão descarregamento E aí você pipeta ele leva tudo para o fundo nessa hora que você coloca se você tiver virada em cima do Pocinho e vai lá para o fundo um pouquinho de dispersão que da solução normal agora esse nosso Líder ele tá pronto apertar

só que tem que colocar 10 micro litros dele hoje está aqui para 10 micro litros o e colocando isso aqui tá pronto para correr eu vou colocar aqui no canto né como de costume geralmente celular você coloca no cantinho no primeiro posto ou no posto do meio Já fechou dá uma olhada aqui de cima como ficou a e agora tá pronto para correr ó eu resolvi colocar apitar um pouco mais aqui da do Sol tampão de carregamento sem amostra só para vocês terem um outro ângulo da propriedade dentro do Gel tá eu vou colocar aqui

eu tô meio torto aqui mas eu estou enxergando que eu tá bem concentrado né porque ele tá vazando quer falar Beleza faz um pouquinho normal fazer um pouquinho aí que eu deixei ele bem concentrado pra gente conseguir vocês vão ver lá na hora que a gente revelar esse gel que ele vai estar vai a gente vai ver essa manchou na preta que eu deixei o tampão de carregamento muito concentrado mas era bom pra gente visualizar Beleza então vamos lá vamos vamos colocar essa eletroforese para funcionar tudo pronto para gente colocar a nossa eletroforese para funcionar

nem a fonte você vai ajustar aí a voltagem de acordo com a sua necessidade Então veja aí qual é a sua necessidade para você chegar aí na voltagem adequada para o suas condições tá aqui eu coloquei 75 você eu vou trabalhar com 75 volts e vai correr por uns 40 minutos mais ou menos tá bom não esquece amostra perto do polo negativo distante do Polo positivo que ela me grau científico do colégio vai ligar para outro lado que são você pede só almoça Então tá aqui nesse caso aqui esse aparato aqui ele não deixa encaixar

de um jeito diferente do certo então encaixou polo negativo Polo a voltagem adequado vou dar o start aqui e tá valendo Daqui uns 40 minutos a gente volta tá E aí [Música] [Aplausos] e [Música] [Aplausos] [Música] [Aplausos] [Música] já finalizar a nossa parte teórica só quero falar aqui para vocês né que não tem problema gente visualiza o resultado de uma eletroforese não dá pra olhar pegar eletroforese correu olhar livre DNA não dá para ver porque de me arranhar não emite fluorescência se a gente não consegue visualizar uma mulher nem precisa fazer alguma coisa para visualizar

sua molécula então geralmente o que se faz é a social Daniela arranhar a um a gente for e sente é um agente intercalante que quando sim ele que afundariam agente intercalante um a gente florescente tem a feeling os críticos quando ele se associa o ácido nucleico depois de citado ele emite fluorescência em geral a luz a gente consegue ver a gente vai colocar essa molécula que vai imprimir ali no DNA se o DNA tiver presente ele vai tirar a luz e a gente consegue visualizar as aluno certo muito utilizado no caso de eletroforese foi utilizado

era utilizada ainda o brometo de etídio prometido uma mulher qualquer utilizado Nem tenho saguim também que é o que a gente tá utilizando nessa aula prática importante colocar a quantidade adequada do seu agente intercalante aqui no seu corante nem muito nem pouco seu colocar pouco você não consegue visualizar se você colocar muito você distorce a eletroforese tô dependendo da Dependendo do que você utiliza e como a gente corante né com essa gente florecentina para detectar quantidades Muito pequenas é de 1 a 100 monogramas de DNA ou RNA por banda é essa quantidade que você quer

colocar nessa colocar o excesso aqui também ele distorce a eletroforese é legal né fica com essas bandas todas as torcidas aqui então mais ou menos a isso que você quer como se primeiro exemplo aqui certo vai colocar muito que vai pode dar pepino aí para você vamos realização da mostra geralmente é realizado por lamento gente florescente que eu acabei de falar para o meu direitinho de muito utilizado um popular é foi muito popular é até hoje ele demanda por volta de uma grande amostra é citado nos ultravioleta porque ele não basta está associado ao DNA

para brilhar tem que está associada ao ganhar ali concentradinha e você jogar uma luz nele com comprimento de uso específico aqui é sinta florescência dele para ele brilhar no caso do brometo de etídio à luz a cumprimento de luz que excita sua florescência luz ultra-violeta no caso seiberling que alguém está utilizando lá na aula prática ele é citado por nos Azul os a vergonha de demanda e de 25 microgramas A3 monogramas de DNA ou RNA para a gente conseguir detectar certo e que dá para fazer quatro frase monte de coisa a gente consegue Bom dia

experimento como esses que a gente tá fazendo agora resultado de uma PCR de uma clonagem e má digestão por enzimas de restrição dá para fazer quantificação de ácido nucleico não é o melhor método de classificação mas dá para fazer quantificação na quantificação das bandas consequentemente a quantificação do azul crê dá para fazer análise de Pureza e integridade muito utilizada nas integridade e pureza para você ficar se você tem um DNA contaminado com RNA ou vice-versa reinará contaminado com o DNA da para detectar recuperar facilmente ter esse também que você pega um fragmento de um todo

de uma pessoa R por exemplo que está fazendo ali quiser levar as consequência mente uma clonagem depois dá para fazer certo um com isso a gente finaliza a outra hora que vamos voltar lá para bancada para finalizar a ver se a reação funcionou que te deu tudo certinho Nossa Floresta multifuncional que Já correu o joãozinho tá bonitinho Parece que deu tudo certo agora a gente vai fazer vamos pegar o gel e banhar uma solução que vai marcar o DNA uma aqui no nosso caso é DNA vamos fazer isso agora então nós vamos utilizar aqui nesse

processo de potinho o marcadores aí diferentes soluções agentes fluorescentes no seu processo poderia ser o Cyber bullying por exemplo a gente vai trabalhar com Cyber que Teoricamente é mais seguro né da aliás tem um vídeo se você trabalhar com brometo de etídeo tem um vídeo chamado o mito prometido que eu fiz aqui não faz não tem que fazer alguns meses que eu deixei que eu fiz aqui no canal dá uma olhada lá sobre o objetivo que é muito legal aqui hoje nós vamos trabalhar com saiba que hora que a mente é mais seguro vão trabalhar

aqui com tranquilidade só que é o seguinte como é que nós vamos fazer o quê que poderá lhe ser feito você colocar o saiba diretamente na amostra ou seu agente floresceu diretamente na mostra aqui no caso pegar um gel e banhar o gel em uma solução que está integrada com saber que não sabe onde vai entrar no Jovem impregnar o gel curando consequentemente o nosso ácido nucleico nosso Daniele certo a gente vai fazer então só que para banhar o gel você não vai você vai colocar em um recipiente um recipiente conversa aqui não tá com

é mesmo e só tem que ser de plástico tá bom não posso ter de vidro cabeça Então prima a fazer é preparar o tupperware o nosso recipiente para receber os abre a mostra ele vai ficar ali banhando por alguns minutos só que como saiba ele é sensível à luz é interessante você trabalhar primeiro fazer esse procedimento no lugar escuro e preferência e um Tupperware que você quiser utilizar É legal você protegendo da luz então você pode embrulhar ele em papel alumínio que a gente vai fazer agora aqui como está fazendo uma demonstração eu vou dar

uma ligadinha e não vai ser não vou fazer nada muito perfeito não mas eu só quero que vocês vejam racional vou colocar tampa aqui vamos fechar aqui a tampinha e eu coloquei aquela já tá mais protegido da Luz vamos fazer a mesma coisa para a parte de baixo e o seu laboratório você vai fazer isso com cuidado vai prender com fita né não vai fazer o negócio porque nem eu tô fazendo aqui porque se eu quisesse com frequência eu que vou usar uma vez e não vou usar mais aqui no laboratório eu vou deixar ele

há mais ou menos aqui só para para nossa demonstração hoje tá e quando você quiser e faz bonitinho mas eu quero hoje é porque o teu cheiro da luz a gente vai fazer agora E aí Tá beleza depois a gente vai colocar a solução aqui e fechar agora que eu recipiente está pronta aqui que a gente pode fazer é simplesmente colocar o site Jardim Luiza na solução tampão que solução tampão que ele vai utilizar a mesma solução tampão tá aqui que a gente procura a gente fez lá no começo do vídeo a gente utilizou isso

daqui a mesma sobrou a gente vai utilizar ela se você precisar se você mais faz o que não é legal você pegar a solução que você utilizou para correr eletroforese e jogar aqui dentro para fazer sua demissão tem que ser uma solução fresca fechou o que você vai fazer é esse o Cyber ele vem concentrado 10 mil vezes a super concentrado Então a gente vai fazer uma demissão de tal maneira que ele fique à a um a uma vez é isso gente quer aqui para gente para o nosso Mundial pequenininho nesse recipiente 200ml de solução

com o saiba já é o suficiente pra gente banhar o gel tá bom que que eu vou fazer pegar 20 minutos daqui colocar aqui dentro e despejar a solução tampão é isso que eu vou fazer tá bom ó esse aqui ele congela fácil tem que deixar as utilizar deixá-la temperatura ambiente Deixa ele chegar em temperatura ambiente eu já deixei aqui no meu que ver se tá com 20 micro litros 20 micro litros Tá certo e ele vem dá para fazer muito muito já com quanto que vem aqui só vou colocar aqui os 20 micro litros

colocando ali dentro e eu já medi os 200 ml de tampão e eu vou só despejar aqui e pronto agora você vai fazer eletroforese acabou nós vamos abrir e pegar o nosso gelzinho daqui com cuidado na hora de tirar aqui com cuidado que ele desliza né tá colocando água embaixo tem uma camada de uma água não tenha uma camada de tampão embaixo ele pode deslizar Então faz com cuidado mas que você vai fazer é soltar aqui ó dá para ver aí soltando pronto e deixarei se tiver DNA você precisar aí funcionou se tiver ácido nucleico

que ele vai ele vai ficar vai ser curado Tá bom tô fechar só para proteger de luz ele vai seu laboratório e apaga a luz também vou deixar um lugar mais escurinho e deixa no Shake aí vai deixar de 20 a 40 minutos nós não deixar 30 minutos aqui não deixar no meio do carro nem no mínimo e no máximo 30 minutos que eu acho que ele já vai funcionar bem que eu ligando aqui a beleza agora vamos ficar esperar mais 30 minutos aqui banhando e a gente volta para verificar se esse já funcionou né

Beleza deixamos 30 minutinhos o nosso gel ali curando não saiba tá amanhado aqui ainda protegido de luz e agora a gente vai colocar no teu coração Vingador não dá para pegar e olhar ali diretamente Sim nós temos o DNA se tem algum amplie com você não tem né Porque apesar de a gente tá utilizando aqui uma gente florescente poderia ser um brometo ainda tá utilizando Cyber a fluorescência dele tem que ser excitada nós vamos você tá fluorescência de se a gente for excelente aqui nesse equipamento tem uma luz que vai ser inserido aqui entendida nessa

mostra aqui esse gel e Onde tiver DNA concentrado nós temos saiba concentrado e aquela florescendo saber vai ser citado a gente consegue detectar tem um sistema de detecção quem pode ver pode visualizar menos olhar para ele mas utilizam-se uma detecção aqui desse equipamento sai já tinha fazer cada a gente falou assim o comprimento de onda específico nesse caso saiba a gente tá dignos azul para enfeitar florescência se fosse um prometido seria é luz ultravioleta vamos lá vamos ver se deu certo legal você no seu laboratório fazer seu cuidado utilizando uma espátula né que a gente

tá mais tranquilo eu vou tirar o gel aqui na mão mesmo eu sei se mudar para pegar aí na câmera antes como é que ele tá ó Foi derrame derrame e vão abrir aqui e me colocar eu tô aqui no já tenha a luz ele vai vir aqui de baixo para cima coloquei uma bandeja aqui para filtrar a luz azul então de novo né faz com cuidado isso e usa uma espátula de preferência no seu caso eu tô colocando ali e aqui no tempo de segredo que que você vai fazer tirar e as bolhas tem

que ficar bolha aqui embaixo né ficou uma belezinha de ar tira bolinha de ar máximo que você conseguir só empurrando e às vezes porque tá molhado aqui ele ficou um a película de tampão embaixo do gel já começa Sambaqui enquanto você tá Tá capturado em baixo mas deixa aqui bonitinho agora vamos ver se deu certo não fechar tem que aparecer alguma coisa e Como selecionar aqui me e para capturar ele vai ficar agora encontrando a o tempo de exposição adequada e a gente vê daqui a pouco sim se deu certo ou não capture image ele

deixou exposto aqui ele deixa a câmera dele recebendo luz por um tempo ao tempo de exposição já deu para vender os cartão bom sinal Só que ele deixou demais estourou aqui tá até vermelhinha aqui estão vendo porque ele captura muita luz sempre tivesse só olhando beleza deu certo Deu para ver que funcionam a gente pode aqui deixar essa aqui mais mas sensível não é objetivo dessa aula hoje mas fica trabalhando no sistema de como esse daqui mas dá para gente ver se resultado de uma melhor maneira então eu vou ajustar o tempo de exposição E

aí eu volto aqui para gente ver como é que fica ó Mudamos o tempo de exposição melhorou aqui ainda tá com resolução ruim levo aí tá muito sobreposto um com o outro tiver correr mais também né deixa ele correr um pouco mais de tempo para separar as bandas do líder mas aqui para gente tá ótimo a gente quer ver se a eletroforese funcionou nós está e os banhos ali ó mostra a um que tava mais concentrado e colocou o dobro a diferença da intensidade da banda né a mostra um vídeo colocou muito mais DNA tá

brigando muito mais eu coloquei aqui nesse caso eu uso pessoal coloquei dois Victor Então acho que 2 micro litros tá de bom tamanho o Leather tá tá bem tá fácil de ver também né eu missão cumprida conseguimos que nós queremos aqui temos banda tá funcionando precisarem funcionou Se você não se experimento na vida real Talvez se tivesse que aqui na foto aqui guardasse a informação né processar essa imagem talvez melhorar um pouco a resolução aqui do lado ver mas aqui para o nosso caso hoje funcionou demais mas a gente finalizar te dar um recado importante

para você e o seu interesse mas eu queria antes qualquer coisa agradecer a Meca do fundo do coração tem disponibilizar todos aqui os reagentes é acionado os parceiros ela para gente conseguir fazer a gravação aqui laboratório tudo então obrigado demais Mac por essa parceria acho que nós estamos ajudando as pessoas a entenderem melhor como funciona a e agora o recado importante para você é Amex disponibilizou te ajudar neste processo que se você tiver alguma dúvida se você quiser trocar de reagentes elaborar tava tô fazendo eletroforese mas o resto está caro não tá funcionando direito meu

lado não tá bom se você quiser testar qualquer um a gente que a gente usou aqui seja médico Éder a gente usou sabe por exemplo now the PCR os reagentes especiais se você quiser você laboratório testar vai começar Os experimentos trocado e a gente se quiser testar não importa qual entre em contato com a médica Vou deixar um meio deles aqui embaixo na descrição do vídeo você manda e-mail para eles conta seu caso explica por que que você tá querendo uma amostra vocês vão avaliar enviar uma amostra eventualmente ganhar uma nota para você o seu

laboratório e inclusive deixando especialista de produtos a sua disposição né tá ajudando pra tirar dúvida padronizar ali fazer seus pés eles Estão dispostos a isso então legal uma excelente oportunidade para você conseguir a gente de ótima qualidade aí fazer o seu laboratório ficar mais utilizado Oi e o seu da educação universo a biologia molecular Espero que você tenha gostado gente se vê no próximo vídeo tchau tchau tchau tchau [Aplausos] [Música] [Aplausos] [Aplausos] [Música]