Genotipagem de SNPs por PCR em tempo real

o olá seja muito bem-vindo ao universo da biologia molecular eu sou eduardo castán e no vídeo de hoje nós vamos falar sobre uma técnica que transcende o mundo da biologia molecular ele transcendia vida acadêmica ele transcende o mundo dentro de um laboratório e essa técnica que é a genotipagem de snippets por pcr em tempo real ela com certeza tem um impacto directo ou indirecto aí na sua vida então se liga no vídeo hoje o que ele está show de bola olha só antes a gente tocar a vinheta não se esqueça de deixar o seu like

aí para mim se você gostar do vídeo e claro se você gostar bastante seu compartilhe com alguém com alguém seu laboratório um colar que pode se interessar por esse tema aqui e não se esquecendo é você não for inscrito no canal se inscreve em dá para você se inscrever clicando aqui no logo do universo da biologia não é claro aqui no vídeo mesmo é só você se inscreve que tá tudo certo então vamos para ela toca vinheta e aí e aí ah beleza então vamos lá que não te faz bem simples por pensar em tempo

real antes de começar deixa eu falar algumas coisas para vocês dois recadinhos aqui bem rápido sabe se por um acaso você está assistindo esse vídeo aqui e você ainda não está inscrito lá no universo da meu davi o mal ponto com você não fez seu cadastro no site faça o cadastro você só tem deixar seu e-mail mais nada porque é através das pessoas cadastradas que eu consigo informar quando sai uma nova aula toda vez que tem alguma novidade quando eu faço um evento como o evento da semana retrasada né de expressão gênica então é através

desses e-mails cadastrados aqui que eu consigo me comunicar mais adequadamente com vocês além disso se você quiser me seguir lá no instagram do arroba universo da biomol vai lá porque ali o conteúdo ele é um pouco diferente né ali tem um conteúdo de área aqui no youtube o conteúdo as minhas aulas são mais compridas só lá no instagram o conteúdo dele é diário e as aulas são mais curtinhas são pedaços de aula seu organismo raciocínios e coloco ali separadinhos organizadinho seus no instagram todos os dias tá bom então vai lá se cadastrou não resolveu o

vulcão e me segue no arroba universo do mal e no instagram para você que vai começar assistir a sala agora eu tenho um outro recado que é em relação ao conteúdo que você precisa já saber para entender o que eu vou falar aqui por exemplo apesar de a gente ter eu falar de alguns conceitos sobre pcr que é o longo do dia de hoje eu não vou estar introdução pc então você tem que ter um conhecimento sobre esta técnica que a mesma coisa serve para pcr em tempo real ano não vou explicar como funciona pensar

em tempo real vou dar uma priscila linha de leve ali mas eu não vou explicar com a funcionar pensar em tempo real e você precisa ter uma ideia de como funciona os primeiros a o conceito de hibridização temperatura de mel tem essa e eu também não vou entrar em detalhes sobre isso então se você ainda não tem o conhecimento mesmo que superficial sobre percepção em tempo real e hibridação de primes esses conceitos assistir às aulas que estou colocando aqui em cima antes dá uma olhada lá na city 1 x 2 foi assistir rapidão e aí

depois você volta para cá para entender muito bem o que eu vou explicar aqui beleza e me ajuda a subir a hashtag hashtag biomol não é difícil porque esse é o objetivo disso que nós estamos fazendo aqui que é democratizar o conhecimento sobre biologia molecular e áreas relacionadas então me ajuda a subir essa hashtag é uma coisa que eu esqueci de falar aqui olha que acho que é relevante em relação instagram lá no instagram também estão rolando algumas discussões muito muito interessante sobre desenvolvimento de carreira dentro da área de biologia molecular e o áreas relacionadas

a biologia molecular ea gente tá falando bastante sobre isso lá e e tá surgindo bastante assunto legal então se você aí sei lá talvez você esteja o emprego o preço da finalizar o mestrado doutorado e diz é saber mais se preparar melhor para o desenvolvimento da sua carreira entra lá no instagram porque é estamos conversando bastante sobre isso ea tendência é aumentar mais porque as pessoas estão gostando tá bom porque o universo deu mal não é só sobre a técnica biologia molecular pode sair outras coisas relacionadas ao mundo da biologia molecular como o seu primeiro

emprego talvez só como dicas de como passar no concurso não que eu vou falar sobre todos esses temas mas a informação vai tá lá em algum momento vai tá lá então então vamos lá para gente ter um contexto aqui do que eu vou falar eu já não vou falar snape logo de cara pensar em tempo real tenho que fazer um texto porque essa técnica aqui ou essa aplicação dentro da técnica da pcr em tempo real se vocês vão ver que não necessariamente precisa ser feito por pcr em tempo real mas essa aplicação aqui ela é

muito versátil como eu disse na introdução do vídeo ela transcende o mundo de bancada o mundo acadêmico né ela tem uma aplicação ela a aplicação prática direto aí na sua vida direta e indiretamente na sua vida você pode comprar serviços que utilizam esse tipo de análise aqui então é pra ter um contexto para vocês entenderem dentro que eu vou falar que eu vou fazer uma introdução olha só primeira coisa de tudo porque que as pessoas pesquisadores por quê que é uma unidade que nós temos a necessidade de analisar uma molécula como a molécula de dna

porque as pessoas pesquisadores analisam moléculas de dna olha só basicamente são dois motivos principais o primeiro motivo é para você ou para os pesquisadores obterem informações funcionais que é possível de se obter ao ler a molécula de dna é sobre isso que nós vamos falar existe o segundo motivo também que aparece fazer identificação de coisas a identificação de espécies de micro-organismos de identificação humana mesmo não é possível utilizar a molécula de dna a estrutura da molécula de drenar para fazer é identificação e hoje nós vamos focar nas informações é porque uma molécula de dna ela

carrega um monte de informação é o que a gente vai ver daqui a pouco isso a gente conseguir leu encontrar onde está sem informação e traduzir aquela informação em algo que seja útil para nossa vida pode ser algo fantástico é isso que a gente vai ver agora então vamos começar com essa contextualização aqui depois a gente vai lá para a parte de slip sem ser por esse por pcr em tempo real olha só porque então que as pessoas pesquisadores que a humanidade tem necessidade nanalisar molécula de dna dá uma olhada nisso aqui isso aqui a

constituição é a composição do corpo humano tava falando do corpo humano aqui mas a gente pode expandir não exatamente essas proporções mas esse raciocínio que eu falo para vocês para outras espécies também você já sabem que aí eu boa parte do nosso organismo é constituído de água e varia de pessoa para pessoa mas não fala que mais ou menos sessenta e cinco porcento de água tem uma outra parte que é de lipídios sim uma boa parte aí talvez eu segundo a molécula o grupo de moléculas que o compõem maior quantidade o nosso organismo ou organismos

de uma maneira geral são as proteínas são quinze por cento mais ou menos nosso corpo ele é feito de proteína só que o negócio é o seguinte da onde que essas proteínas vem são as proteínas que a gente come carne ovo queijo posição que a gente come não essa proteja a gente come ela é quebrada era digerida e depois ela é a quebrada estruturas menores ou tem aminoácidos né que são unidades formadoras das proteínas para depois dessas mulheres serem absorvidas e depois remontadas pelo nosso corpo e aí sim gerar as proteínas que são constituintes do

nosso organismo os outros alimentos então acho que ela ainda onde elas estão né então que são só alguns exemplos de proteínas tipo unha cabelo a proteína sangue lá no sangue tá cheio de proteína uma das proteínas mais importantes do para manutenção da vida a hemoglobina que transporta o oxigênio no sangue né cérebro levo constituído basicamente ou um grande quantidade de proteína também mensageiro celulares são proteínas a discussão basicamente proteínas em outras várias atividades como a própria manutenção duplicação do genoma as enzimas são proteínas anticorpos são proteínas então essas quinze por cento do nosso corpo é

dos outros o riso também são fundamentais eles desempenham funções importantíssimas e como eu estava falando para vocês dá onde vêm essas proteínas aqui já que não é a proteína que a gente come diretamente elas vêm por que nossos organismos tem a capacidade sintetizá-las em algum lugar dentro do nosso organismo existe uma informação armazenada codificada de uma determinada maneira que quando ela ativada quando ela recrutado tem a capacidade de sintetizar uma proteína humm parte de uma proteína e aonde está armazenadas informação a informação está armazenada no nosso genoma ou não conjunto de moléculas de dna presente

cada uma quase em todas as salas do nosso organismo então a informação está o site o vídeo tchau raciocínio aqui é proteína é boa parte da constituição de um organismo e além de ser boa parte tem milhares desempenho milhares e milhares de funções aí nos organismos e para essas proteínas serem geradas existe uma informação que está guardado em algum lugar essa informação está guardada dentro do genoma ou no conjunto de moléculas né o genoma é o conjunto de moléculas de dna de uma célula de um tecido ou de um próprio organismo então é daí que

vêm as proteínas e agora a gente tem um contexto maior então se a gente pode pensar em mais ou menos a gente pode fazer uma analogia como se o genoma ou a molécula de ganhar fosse a receita da vida porque se lá no genoma tá armazenada tudo informação para produzir essas proteínas essas proteínas tem esse desempenho essas funções mil aí dentro dos organismos lê a molécula de dna é como se tivesse lendo uma receita é como se ali dentro daquela moleque oh dentro daquele conjunto de moléculas tivesse todos as e esses para a manutenção da

vida para a criação da vida e manutenção da vida e assim por diante então lê a molécula de dna é como se tivesse lendo um livro de receita com todos a todas as informações necessárias para que a vida aconteça né e ah moleque outra organizada dessa maneira que vocês eu tô passando aqui rápido porque eu estou assumindo que vocês já sabem se vocês não sabem volte aí da aula tem uma playlist vou deixar playlist aqui também a playlist é comece por aqui na playlist comece por aqui tem uma aula introdutória lá falando explicando e só

que eu tô falando pra vocês em maiores detalhes mas necessários estão vocês podem assistir por lá também é o arco de dna tensa a constituição que ela formada por essas unidades que são as bases e as bases nós temos basicamente aí quatro tipos na molécula de dna a adenina citosina guanina e timina que estão associadas uma outra fita complementar como é que eu estou mostrando aqui aconteça com gg conceito e com a ser que um dia aconteça importante e essa molécula aqui o organizado dessa maneira tem aquela famosa estrutura dupla tudo isso aqui é como

eu disse posso rápido porque é uma parte que eu imaginei que seja mais fácil é só para ter o contexto mesmo só que aí que vem o negócio a informação está armazenada aqui como a gente falou a informação ela está guardada aqui ela está em determinados momentos da vida ela tá dormente ali codificada e utilizada em vários uma envolvidos só que de tempos em tempos em situações situações de acordo com diferentes situações ao longo da vida essa informação que tá e ela é recortada existem pedaços da molécula de dna pedaços de um genoma que podem

ser ativados que eles podem ser recrutados em informação que tá lá se tiradas de lá vai ser retirada de ela ser utilizada de uma certa maneira e quando ela é utilizada como ela é recrutado quando esse pedaço de genoma ou esse gene é expresso há a formação de uma molécula intermediária que é uma molécula de rna e essa molécula de rna t a cidade atento na o objetivo de transportar uma mensagem que estava armazenada no genoma no bloco de dna para o citoplasma da célula e ali ela por exemplo entre outras coisas ser utilizadas para

sintetizar uma proteína o parte de uma proteína então é isso aqui que eu estou mostrando uma molécula de dna existem alguns pedaços essas moléculas que podem ser ativados que podem ser expresso esperar são chamados de higiene um gene por ele é recrutado ele vai a informação está armazenada nele vai ser copiada e essa cópia é feita através de uma molécula intermediária que a molécula de dna é uma molécula de rna mensageiro esse rna mensageiro carrega o código ele carrega informação que a gente precisa que a célula precisa para desempenhar uma determinada função pode ser inclusive

é a geração de uma proteína e essa molécula de rna carregando uma mensagem no citoplasma em associação com o ribossomo associação com rna transportador a força avense transporte diferença aminoácidos tem a capacidade esse grupo se conjunto até capacidade de sintetizar uma proteína ou parte uma proteína ligando um aminoácido um outro em uma sequência específica que é correspondente a essa sequência aqui do rna mensageiro que por sua vez é uma cópia do que estava armazenado armazenado lá no genoma então é dessa maneira que a gente consegue pegar uma informação a molécula que armazenar uma quantidade imensa

de informação utilizar essa informação quando ela é necessária utilizando aí por meio desse mecanismo que eu acabei de mostrar para vocês ou seja se a molécula de minha carregar todas as informação ela como se fosse um livro de receita em toda a informação que a gente precisa para geração manutenção da vida ele pode dizer que basicamente quase tudo que está relacionado à vida tá aqui dentro tá armazenado ou codificado dentro do a tcg das letrinhas aí que codificam a informação genômica e olha só aqui são alguns exemplos né de informações que tornam antenadas lá no

genoma que são ativadas são recrutados de tempos em tempos para gerar uma característica por exemplo a cor do olho cor da pele a cor do cabelo e essas características relação é produtos do da expressão de um gene da expressão de um genoma e em relação ao ambiente que aquele indivíduo vive altura mesma coisa tão altura é uma característica gerada controlada por vários e vários genes que todos atuando combinando funcionando ao mesmo tempo em uma determinada sincronia uma determinada intensidade vão gerar característica final que altura por exemplo a mesma ideia para aptidões físicas pessoas têm claramente

de 100 pessoas com maior aptidão a praticar esporte é onde se desenvolver fisicamente tem outras pessoas que têm maior facilidade para desenvolver aptidões intelectuais tudo isso é a interação do genoma a ação armazenada do genoma de um determinado indivíduo com o meio daquele indivíduo vive tão é assim que as coisas funcionam assim que a vida funciona tô dando aqui alguns exemplos né que são clássicos sempre que a gente estuda dna já não nessas coisas são esses exemplos que aparecem mais se vocês pararem para pensar bem é tudo que está relacionado à os seres vivos têm

uma relação direta ou indireta com o dna com o genoma a interação daquele genoma com o meio como por exemplo a capacidade de uma pessoa focar em uma atividade ou a capacidade de um indivíduo o acordar cedo que que ele prefere dormir mais tarde acordar mais tarde dormir mais cedo acordar mais cedo que hora ele funciona melhor tudo tudo que te pensar que está relacionada à vida tem um pouquinho pelo menos um pouquinho de interferência do genoma da interação do seu genoma com o meio e isso serve também para pré-disposição de doenças se a gente

vê a doença que é hereditária uma doença genética o que tem pelo menos uma parte componente genético a essa informação por parte da informação que armazena lá no genoma também a gente consegue se a doença genética ou tem uma parte genética uma contribuição genética do desenvolvimento aquela doença analisando o genoma de pessoas e organismo gente conseguem ou talvez para dizer a probabilidade desenvolver uma doença ou alguma coisa em relação a isso e aqui tem um caso real é que ficou famoso um tempo atrás seu caso da angelina jolie angelina jolie e ela fez uma análise

de dna com cola descobriu que ela tinha uma hora probabilidade maior probidade que a média do resto da população de desenvolver câncer de mama e câncer de ovário porque como que ela conseguiu descobrir isso porque alguém um dia um pesquisador o grupo de pesquisadores não sei quem que foi que fez isso analisou dois genes dois gêneros um chamados brca1 e brca2 essa que a sequência real do rna mensageiro de um desses dois e alguém pegou analisou a sequência aqui identificou pequenas variações de nucleotídeos aqui dentro e associou essas pequenas variações com maior probabilidade desenvolver câncer

de mama e de ovário simplesmente todo mundo tem a mesmice uma sequência de nucleotídeos dentro desses dois genios aqui no caso o gta sei se todo mundo tem a mesma sequência algumas pessoas têm algumas variações aqui dentro algumas porções não são idênticas em todas as pessoas e alguém diz conseguiu fazer uma associação que a presença de um determinado de uma determinada avaliação aqui estava relacionada diretamente relacionada com a probabilidade desenvolver câncer de mama e ovário isso é muito bem documentado hoje são tipo é uma análise é um teste de dna muito muito realizado no mundo

inteiro então é possível qualquer pessoa que comprar um teste como esse fazer análise da sequência desse desse gênio esses dois genes aqui e saber se tem uma hora o menor probabilidade desenvolver o nome de ovário e angelina jolie no caso ela descobriu que ela tinha essa variação porque ela tinha histórico familiar então resolveu fazer esse teste ela descobriu que tinha essa predisposição é e aí ela tomou uma decisão drástica na vida dela ela retirou a fez a retirada de mama e depois anos depois retirar nos ovários para eliminar o problema e quase que pela raiz

é né pela raiz porque só mudando de nome dela mesmo para ele mais plano de vez mas ela com certeza não vai desenvolver câncer nesses dois órgãos mais porque ela fez a retirada de uma aplicação real que aconteceu ficou famosa demais no mundo nos anos atrás e até hoje isso traz algumas reflexões que não vem ao caso de hoje mas aqui uma aplicação real outras aplicações e a gente tá falando que eu tô falando de humano né focando bastante humano porque é mais palpável de entender mas a gente pode estrapolar isso para quase todos os

organismos e não para todos os organismos e ter aplicações diretas de seu organismo na na vida das pessoas também é por exemplo aqui ó o agronegócio é um o os templos são exemplos né de como isso impacta a nossa vida diretamente porque os alimentos que a gente come hoje seja ele vegetal seja animal ele já teve ou tem ele tem ainda mas já teve no passado na a interferência da manipulação genética seja lá diretamente na molécula ou a através da sua análise da sua leitura para selecionar os indivíduos que sejam mais atrativos economicamente tá um

alimento que produz o milho por exemplo que produz em maior quantidade que tem menor chance de ser contaminado por um patógeno ou que têm uma resistência à seca no caso de animais vacas maiores produtoras de leite ou o seleção de bois com carne mais macia coisa desse tipo são seleções de organismos são melhoramento genético de um organismo que podem ser feita a travessa da assistência de variações genéticas e no caso aqui a seleção assistida por marcadores moleculares e a gente vai chegar lá mas são exemplos reais da nossa vida que esse tipo de análise aqui

tem um impacto é exatamente na população beleza então agora sim então a gente fechou e raciocínio aqui já deu para entender o porquê que é importante porque que as pessoas analisam dna para o que que a gente consegue obter informações através da leitura da molécula de dna só que agora vem eu quero que você se associem comigo negócio aqui a gente consegue obter essas informações lendo a massa de terra mas basta como é que a gente sai do lugar né como é que a gente consegue pegar uma molécula de dna como que é possível ler

a hora que os veniais alguma informação dali apaga só eu não sei quanto de vocês eram mais velhos na época que o projeto genoma humano ele foi concluído e foi concluído e foi um grande alvoroço na época saiu nas principais revistas científicas do mundo é saiu na science na mente dos projetos porque aconteceram acho que se não me engano paralelo já não lembro direito mais mas o fato é que saiu o genoma o projeto genoma humano foi concluído e significa aqui o a sequência e do gênero humano tinha sido decifrada todo o genoma tinha sido

sequenciado e nós agora com uma idade sabíamos qual que era a sequência de letrinhas a tcg lá no genoma de todos os cromossomos que nós temos o nosso nas nossas células e aí foi um alvoroço por que começaram a falar agora algo a humanidade vai mudar agora a gente vai conseguir fazer isso xyz falar um monte de coisa e no final das contas não foi isso que aconteceu não não curto prazo pelo menos porque imagine você se eu te der agora um papel um papel não ser um papel muito grande mas se eu tivesse uma

informação lá em um arquivo sei lá com toda a sequência com todas as bases todos os nucleotídeos do genoma humano na ordem certinha ao cromossomo 1 de ponta a ponta as letrinhas atc gca que quiser fazer com essa informação a nota não dá para fazer nada porque uma sequência de letrinhas ali tem uma coisa que aquele negócio está codificado não tem como você ler diretamente nem dá sequência letrinha simplesmente não tem muito o que fazer o que você precisa o que as pessoas o que as os pesquisadores possam fazer é pegar aquela informação e traduzida

de alguma maneira e não é um negócio fácil de fazer eu vou dar um exemplo que eu já falei antes disso que eu tô tô dizendo para você imagine se você tá com essa sequência aqui na mão aí como que você vai conseguir associar uma determinada avaliação ali no meio daquele negócio gigantesco que tem informação para caramba no caso de uma nação por volta de 3 bilhões de bases então a gente que você tem 3 bilhões de letrinhas como que você vai encontrar nesses três milhões de letrinhas aí uma variação algumas variações que estão relacionadas

ou tem responsabilidade no desenvolvimento de câncer de mama e de ovário por exemplo então não é um negócio simples o que acontece é que é possível sim algum momento traduzir essa informação e as os como foi o caso do câncer de mama e de ovário do brca 1 e 2 associar essas variações a característica de interesse encontrar lá dentro desse genoa por exemplo quais são as letrinhas que mudam de um indivíduo para o outro que fazem com que uma vaca por exemplo seja melhor produtora de leite do que outra que algumas pessoas têm maior chance

de desenvolver doenças do que outra ou variações que estão associadas a uma aptidão intelectual oi aptidão física e assim por diante então é possível nesse processo de tradução encontrar quais são essas letrinhas quais são essas variações que diferem organismo do outro que talvez é tragam vantagem para alguns indivíduos e desvantagens para o outro e assim por diante certo esse para chegar nesse processo funciona mais ou menos assim aqui é um parente que vou fazer na aula só para vocês não ficarem perdendo nesse momento são três fases basicamente para chegar a esse resultado final como é

o caso do brca1 e brca2 o primeira fase é sequenciamento você os pesquisadores sequenciaram em as o gene a sequência de nucleotídeos e um genoma de uma determinada espécie como aconteceu no caso humanos então a primeira fase é sequência a sequência tudo de ponta a ponta ou parte pelo menos daquele genoma até aí nenhuma grande informação a não ser a sequência das letras não seu código em si depois existe uma segunda fase que é uma fase de associação é quando algum pesquisador um grupo de pesquisadores as pessoas elas vão pegar essa sequência e tentar identificar

associar variações na sequência com uma característica de interesse vou dar um exemplo esdrúxulo aqui para você entender o raciocínio nagini que vocês têm uma população de pessoas que tem cabelo preto e uma população de pessoas que tem cabelo loiro aí você se conhecia o genoma desses dessas duas populações aí vocês vão encontrar uma sequência idêntica para quase todos todos os indivíduos independente qual a população seja só que algumas sequências algumas variações vão correr e objetivo é de uma maneira grosseira é encontrar variações e a variações no genoma que sejam comuns as pessoas de cabelo preto

e variações do genoma que sejam comum as pessoas cabelo loiro talvez por aquele grupo ter variações que sejam comuns exclusivas a ele talvez justamente pelas variações sejam relacionados o estejam directamente ou indirectamente relacionados com a loirice delas ou com cabelo preto das outras entendeu tem um processo de associação que se faz em geralmente que trabalhando com muitas e muitas e muitas amostras essa segunda fase uma vez que essa associação é feita depois de ter um trabalho estatístico muito bem elaborado um trabalho é uma estatística robusta o suficiente para você poder fazer associação associação uma vez

que isso está feito vai para 3ª fase que é quando você utiliza isso na prática essa informação na prática como de novo e o caso do brca1 brca2 essa associação alguém um dia sequenciou o genoma humano alguém um dia fez associação daquela variação com a probabilidade de desenvolver câncer e agora laboratório vou pegar esta variação e utilizar no sé si es por exemplo que eles oferecem no dia a dia então você pode como eu disse comprar um teste de se um determinado laboratório qualquer laboratório de clínico de faz biologia molecular que trabalha com lados molecular

e provavelmente oferecer esse teste aí você pode pegar e compras testes então utilizar isso na rotina na vida das pessoas os laboratórios o que é que seja tá então primeira fase sequenciamento depois segunda fase que é associação e aí por último o uso rotineiro daquela informação daquela associação certo e agora a gente entra nos marcadores moleculares que são justamente essas variações que já foram associadas a uma característica de três seja ela interesse comercial interesse na saúde etc são variações da molécula de dna variações no genoma de um determinado indivíduo de de organismo e já estão

associados às características que tem algum interesse aí para as pessoas que que é isso daqui regiões genômicas polimórficas associadas a car o interesse eu não mencionei diretamente apesar de ter falado anteriormente eu não falei diretamente a parte de polimórficas elas tem que ter mais de uma forma que são justamente as variações o genoma inteiro aí eu vão falando de organismo de humano de novo aí 99.5 99.9 não sei do genoma de todos os seres humanos a idêntico tem a mesma sequência de letrinhas mas existem algumas pequenas variações ou regiões que tem mais de uma forma

são polimórficas e essas regiões são justamente as regiões que que são responsáveis por diferenciar um indivíduo do outro então para você utilizar um pedaço da molécula como um marcador ou seja o marcador molecular essas regiões elas tem que ter diferentes formas polimorfismo é isso é aí que diferencia um organismo do outro e aí que você é diferencia por exemplo um loiro de um moreno um exemplo né ah e essa esses marcadores essas variações no genoma elas podem ter uma influência direta a geração da característica como é o caso de novo do brca1 e brca2 é

uma variação dentro da molécula é uma variação dentro da molécula está dentro de um gene essa variação ela vai alterar o códon que por sua vez vai alterar o aminoácidos da proteína que vai ser gerada que por sua vez vai aumentar a probabilidade de desenvolver câncer então é uma variação que está diretamente relacionada com a causa da doença ou com a geração da doença mas existem associações que podem ser feitas indiretamente estão a potência direta na geração da característica o está em apenas associadas por desequilíbrio de ligação e para a gente resumir aqui para ela

não ficar muito grande o seguinte é simplesmente a presença de uma variante está associada a característica interesse e não necessariamente ela causa aquela aquela característica ela tá responsável pela redação daquela característica ela elas estão associadas de alguma maneira sempre que a variação está presente existe a característica também ela ainda que essa variação não tem e direta na geração da característica ela quando uma está presente a alta está presente também isso porque elas estão a avaliação está fisicamente próxima lá no genoma dos genes do gênio dos genes que causam aquela característica aquela determinada característica é só

para resumir é mais ou menos isso daí olha só vamos sair de exemplo do rc aqui vão passar para o outro temos aqui um exemplo real dentro do cromossomo 13 existe um gene chamado htr2 a que é um receptor de serotonina e lá na posição no cromossomos 13 lá no cromossomo 13 no nucleotídeo de posição 46813531 três existe uma variação de um único nucleotídeo uma variação de um cliente de lá se você pegar o cromossomo 13 e foi controlado o primeiro nucleotídeo no primeiro a base um dois três quase aí chegar lá na na base

46813531 três você vai chegar no nucleotídeo e a uma citosina tem uma ligação de ser com g quase todas as pessoas no planeta têm nessa base aqui nessa região especificamente um a citosina uma agonia todo não tem uma citosina e guanina mas algumas pessoas no lugar da citosina tem uma adenina né e fica um a ter ou tem uma tímida fica um pa a variação zinho aqui é uma variação de um único nucleotídeo só que acontece que essa pequena variação zinho aqui ela está associada a variação comportamental tão pessoas que tenham ao ter outras outro

nucleotide além dos e aqui podem ter aí talvez o maior risco de desenvolver depressão por exemplo ou está relacionado também a disfunção sexual quando se tratamento que eu não tava ficando essa pessoa está sendo tratado com a determinada droga lá ou tem uma ó vou ter uma relação também com comportamento suicida então veja aqui simplesmente a troca de uma citosina por uma adenina ou por uma timidez um dos casos existe essas variações aqui na característica uma oração lá no genoma não era só lá no genótipo causa uma variação na característica ou no fenótipo aqui no

caso é uma troca de ser por ao por ter que está associado a risco de desenvolver depressão e disfunção sexual comportamento suicida e tem outras várias é características aqui ó vários fenótipos associados a justamente essa troca de ser por outra outro nucleotídeo daí eu tenho tô falando aqui por exemplo de uma troca de um de um ser por um ter um ser por um aqui a troca de um único nucleotídeo mas existem outras variações que acontece no genoma que podem ser associadas às características interesse né eu tô mostrando aqui alguns exemplos dessas variações que podem

ser utilizadas como marcadores moleculares aqui tem vários tipos o eu não tenho aqui eu tô mostrando algumas né mas ela mais famosa talvez o rflp que é o polimorfismo tamanho do fragmento e responda o que é utilizado ainda mas foi muito utilizada como se fazer análise por enzima de restrição minhas em cima ela cortar vá ou não cortava um determinado fragmento gerando fragment tamanhos diferentes lá na pcr coisa se tipo então são variações que podem variações namorar com os daniel higienópolis podem ser detectados através da digestão de enzima de restrição depois amplificadas por pcr em

tempo real tem uma outra aqui ó um até um conjunto na verdade que são as repetições as repetições entender por exemplo o microssatélite essa essa esse marcador molecular é muito utilizado hoje em dia ainda para identificação humana ele é fundamental para esse tipo de coisa indicação de organismos também mas é o microssatélite que é um tipo de vm dr é o marcador molecular utilizado para identificação humana teste de paternidade assim por diante e eu que a gente tá focando aqui hoje é o snap né a um polimorfismo e quando existe a troca de um nucleotídeo

por outro e essa essa variação ela pode causar ali uma variação no colo que vai causar uma alteração nome noah se da proteína que pode causar uma variação na própria proteína e ser a causa da variação daquela característica mas ele pode ser também pura e simplesmente estar associado a característica como eu tava falando anteriormente são os exemplos que não são esses polimorfismos de um único nucleotídeo é a substituição substituição de um único nucleotídeo e uma posição específica do genoma e para ser considerado o sleep no geral é essa variação zinha essa troca de um único

nucleotídeo tem que estar presente e mais em um porcentual mais a população né porque se for menos o que está em potência em simplesmente uma mutação pontual aí por exemplo se você sofrer uma mutação ouvindo sofrer uma mutação e essa mutação não foi passada para frente isso não é considerado o snap mas se um por cento ou mais a população tem aquela avaliação e vai considerado um snap tô aqui de novo aqui a gente vai pro outro exemplo agora nós tempo real também tá o exemplo da troca de uma citosina por uma timina no gene

ao fact na três está relacionada ao desempenho de atleta tão pessoas que têm a citosina tem a citosina uma determinada porção na desse gene ela tem a maior predisposição a atividades de força tipo musculação e levantamento de peso esportes de explosão como corrida de curta distância natação de curta distância que aí são os velocistas por exemplo mas em uma doença a mesma região algumas pessoas têm uma tina e quem tem a timina pessoas que têm a timina têm maior predisposição a atividades de resistência então corridas de longa distância ciclismo de longa distância natação de longa

distância então as pessoas têm uma citosina tem mar pré-disposição atividades de força e que entende mina maior predisposição a atividades de resistência toque no meu exemplo existe e as pessoas que aqui a sequência hoje não é sequência real não tá só para vocês visualizar aqui a sequência do gene em uma determinada porção do gênio na alfa actina algumas pessoas que têm citosina e algumas pessoas têm tímida pessoas com citocinas são maior predisposição a atividade de força que seria pensa atividade esporte como velocista por exemplo e quem tem a timina pré-disposição atividade de resistência tão corridas

de longa distância tipo maratona no caso de um homozigoto então tenho não se esqueçam aqui no nosso não são de humano então organismo diploide você pode estrapolar esse raciocínio para outros tipos de organismo também mais um caso de uma né de pode e para homozigoto significa que os dois cromossomos homólogos cromossômica ela recebeu do pai e o cromossomo que ela recebeu da mãe tem citosina nos naquele alelo os dois alelos são citosina então essa pessoa que uma pessoa que é homozigoto para você tem citosina o cromossomo homólogo do pai e o cromossomo modo que recebeu

da mãe a cg mas tem pessoas que estão ao onze gotas para o alelo ter que ela tem te até a ela recebeu do pai esse cromossomo que era que tinha a timina tinha os links aqui com timina e recebeu da mãe também um cromossomo que tinha dinheiro entra lá umas gotas para o ter ela tem atividades mais propensão atividade resistência e tem a terceira opção que são josé ter o zigotos recebeu do pai 16 recebeu da mãe hummm hummm hummm hummm hummm ter ou vice-versa né não ela tem um cg e alguns seus cromossomos

no outro cromossomos ter a essas pessoas tendem a ter um desempenho intermediário para as duas atividades estão de força como de resistência tô aqui um resumo dos três genótipos e consequentemente dos seus pênalti genótipo é a sequência de letrinhas aqui a informação tão genoma e o fenótipo é a característica que a velocista resistência é o intermediário e aí como a gente consegue analisar onde consegue identificar essas variações por exemplo de snipper quem não são dizer como a gente consegue a ficar na prática na vida real quem é cg quem é ou quem é os dois

quanto possível quais são os testes com suas técnicas de biologia molecular que a gente consegue fazer isso dá para identificar snap de diferentes maneiras várias técnicas de biologia molecular são utilizadas para genotipar a discriminar alelos para fazer a genotipagem dos snap pode ser feito por pcr pode ser feito pcr em tempo real pode ser feito pra você conhecer muito sangue pode ser feita sequência geração pode ser de nova geração pode ser feito por marco rei pode fazer por várias técnicas hoje nós estamos falando da técnica de pcr em tempo real por quê porque a mais

utilizada de longe a mais utilizada é uma técnica muito muito bem estabelecida para esse tipo de aplicação e não é caro não é a técnica mais caro tem no mercado ela é mais acessível na várias pessoas vários laboratórios e possivelmente não você vai ter grande chance você fizer um teste genético simples você vai o seu teste seja desempenhado seja realizado por pcr e aí para a gente falar da pcr em tempo real som lembrete aqui rápido porque eu não quero entrar em detalhes sobre a técnica nem como ela funciona né até que a gente pensar

em tempo real técnica semelhante a pcr ou seja é a técnica é a capacidade de fazer várias cópias de um fragmento alvo especificamente só que na técnica de pcr em tempo real de frente o que acontece na pessoa é convencional ao longo da da amplificação de um produto ao longo da desse processo geração de cópias de um fragmento específico a também a geração de fluorescência utilizam a gente ter que a lente que tem a capacidade de gerar fluorescência toda vez que um fragmento alvo ele é formado ao longo da reação de pcr né isso a

gente fosse ela chamado de um tempo real porque a gente conseguiria ver ao longo da pcr a fluorescência aumentando de maneira proporcional à quantidade do alvo tá sendo gerado lá na reação de igual forma pessoa que vai acontecer vai aumentando a quantidade daquele alvo na pcr aumentando o nível de fluorescência daqui por exemplo se os nossos exemplos aí dos esnips nesse último foi dá ao fato tina nós estaremos amplificando aqui justamente a região do genoma que tem alpha que tina mais especificamente lá na ao fact na três a região que possui aquele snipper que ela

avaliação zinha lá que era uma troca de ser para ter aí vocês vão ver como é a simplificação e geração de fluorescência pode gerar a informação do genótipo que é o que nos interação na frente né tem que pegar se isso aqui na pcr em tempo real acontecendo lá os fragmentos amplificando a cada circo ea geração de fluorescência no gerada é de maneira proporcional a cada ciclo também e a gente jogasse um gráfico então geração de fluorescência em relação aos ciclos da pcr nos veremos isso aqui é que são três amostras diferentes a quantidade dos

meus fragmentos aumentando seja cuidar de fluorescência aumentando conforme a pessoa e vai acontecendo né e aí dentro desse plot desse gráfico de amplificação tem aqui uma fase exponencial da reação onde os fragmentos estão sendo aplicado de maneira não existe lá no final da pcr a fase de pato quando todos os fragmentos já foram amplificados não a quais os fragmentos ovos é for amplificado e teve ou não a geração inflorescência teve se o alvo tiver presença e não tiver presente não tem a geração de fluorescência mas no caso de uma de três amostras positivas nós temos

a geração de fluorescência lá no final da reação e é isso aqui que nos interessa analisar é o produto final de uma pcr em tempo real que nos interessa analisar quando a gente faz genotipagem de snap a gente quer saber se houve geração de fluorescência e vocês vão ver que nós vamos colocar aqui uma fluorescência que é específica acabam dos alelos ou dos genótipos que eu quero identificar e para isso a gente pode vou explicar isso com carro para vocês como é que funciona mas para isso pra gente conseguir utilizar pcr em tempo real a

sua propriedade de gerar fluorescência específica de um determinado o álbum de um fragmento alvo é existe algum sistema de detecção algumas possibilidades fazer isso eu vou mostrar dois tipos é um dos tipos através das ondas technos ondas de drones têm um sistema interessante talvez em seja o mais utilizado no brasil possivelmente a mais utilizada no brasil e um outro que através de primas modificados que eu vou explicar os vamos começar com som das teclas e que como eu disse possivelmente esse aqui é o método mais utilizado tá é o mais comum de se encontrar por

aí como é que funciona como é que através de pensar em tempo real utilizando o som das tac emoção das droles é possível fazer a discriminação de alelos vou fazer a genotipagem disney na segunda ataque ela é um ali como que eu tinjo sim muito parecido com um primer é um primo que você utiliza na pcr e assim como um primer a sonda ela ela tem uma sequência específica que vai se ligar especificamente ao seu alvo no caso que se fosse aberta que tinha alpha que tina você ia desenhar um a sonda e desenhar os

primos do ford o reverso que amplifica em um pedaço lado oi e a sonda taqman também e amplificar ela ia se ligar ali em algum momento dentro da do seu do seu alvo na afrodite na entre os primos especificamente só que diferente dos primers nas extremidades 65 linha dessa desse oligonucleotideo da sonda existe uma molécula ligado ali que é um repórter que é uma gente fluorescente é ele que vai gerar a fluorescência de maneira proporcional quando a reação acontecer se você tá acostumado com pcr em tempo real já ele esse oe potter aqui ele é

equivalente é o cyber né que é uma outra mão alto no outro sistema de detecção é um outro tipo de flor off mas aqui esse harry potter é a molécula fluorescente que vai gerar fluorescência toda vez que o alvo foram amplificados na outra umidade existe uma outra molécula chamada de corrente a que ela tem a o objetivo dela estar aqui é simplesmente absorver não é absorver aqui o termo correto de se utilizar mais aqui hoje nós vamos falar dessa maneira é absorver a essência do importa o repórter ele tá aqui dos quando a molécula com

a sonda está intacta do jeito que eu tô mostrando aqui para vocês ela tá do jeito que eu tô mostrando que o vocês aí tá quebrado bonitinho desse jeitinho aqui e esse moleque oh importa aqui emite fluorescência está próximo fisicamente próximo da molécula corrente existe uma troca de energia entre elas uma troca de energia ressonante florescente e essa florescência gerada por pelo repórter não vai pelo meio e não vai para o meio então não tem a captação dessa fluorescência aqui tão coração tá desse jeitinho aqui existe uma troca de energia ea fluorescência num importe não

vai para o meio a gente não consegue detectar essa flor essência só que ao longo da pcr olha que acontece então a gente vocês que a pessoa que está acontecendo ela começou agora aqui nós temos a dupla fita do nosso alvo em algum lugar aqui está o nosso snip aquilo que a gente quer identificar não importa agora mas aqui então a dupla fita dissociada um primer ford se liga em uma extremidade ele foi feito para se ligar aqui um para mim o canal extremidade de foi feito para se ligar aqui eles têm que ser com

específica a sonda se liga em uma das fitas entre justamente aí dos primes e a sonda também tem uma sequência específica feita para se ligar aqui e ela tem uma repórter e um cliente a molécula do jeito que tá aqui existe uma troca de energia essa moleca dormir importa emite uma flor essência que não é captada pelo meio só que ao longo da pcr a dna polimerase mencionando que eu tive de maneira complementar aqui formando a nova fita na fita que não tem a sonda não acontece nada simplesmente ela é formada nova fita formada mas

na fita que tem a sonda a dna polimerase vem com incorporando nucleotídeo ela encontra esse intruso aqui na frente dela ela encontra uma extremidade de cinco linhas livro de um truzzo que tá na frente dela e essa enzima até a capacidade de quebrar essa sonda ela hidrolise essa sonda aqui a molécula importa ela passa a ficar distante da molécula a molécula que encher passa a ficar distante da molécula e porta aqui em troca de energia deixa de acontecer ea fluorescência do harry potter vai para o meio e o equipamento no sistema de pcr em tempo

real capta essa florescência e depois vamos lá kula é sintetizada normalmente formando uma nova fita então aqui quando o alvo foi formado ouvir a geração de fluorescente toda vez que o alvo é formado a geração de fluorescência quando se trabalha com tac só que aqui como que a gente utiliza essas propriedades como a gente utiliza essa capacidade da sonda taqman geral fluorescência dessa maneira para discriminar alelos né para fazer a identificação dos genótipos aqui do velocista do resistência do intermediário acontece que o seguinte ó então nesse sistema quando se utiliza ataque lá para fazer genotipagem

de sleep que que você vai ter lá no seu tubo além dos ingredientes convencionais até ser né você vai ter o plano é forte que especifica o seu fragmento alvo a extremidade do seu alvo você vai ter o plano reveste que especial outro específica ou extremidades do seu alvo e você vai ter uma sonda a ligar ali justamente aonde tem o snap onde tem a variação então aqui nesse caso nós temos uma sonda de uma sequência específica o meu alvo e aqui uma determinada porção um determinado nucleotide dela tem uma guanina que é complementar justamente

a citosina né então aquele alelo que está relacionado à força na proposição atividades de força então essa sonda aqui ela se liga exclusivamente especificamente ao alelo que tem a citosina que são é o alelo dos velocistas e além da lá ter essa sequência específica do alelo da do velocista os alelos c ela tem um repórter e uma determinada cor aqui que eu estou mostrando como azul até um repórter uma a gente fluorescente que brilha que emite fluorescência na cor azul só que além desse seus três olhos nucleotídeos aqui você o quarto é uma outra sonda

que tem possivelmente aí a mesma sequência ou uma sequência é muito parecida da sua outra sonda só que um determinado nucleotídeo ela não tem uma agonia ela tem uma adenina que é complementar a quem ao ter a timina dos das pessoas que têm propensão a atividades de resistência aqui faz o esporte de resistência então essa sonda aqui ela tem um importa era azul e ela se liga especificamente quem tem um alelo c aos velocistas essa sonda aqui ela se liga especificamente quem tem um alelo t ou os que têm resistência só que essa sonda não

tem o repórter azul ela tem um importo de outra cor ou seja a fluorescência que ela gera é de outra cor e como isso daqui vai ser utilizado lá pcr em tempo real então vamos ver estou a pcr em tempo real começou nesse caso aqui a gente já sabe né na para a gente entender que didaticamente quem sabe que nós estamos falando de um velocista ou sejam homozigotos para o alelo c então um primeiro vai se ligar em uma extremidade outro par vai se ligar na outra extremidade nós temos duas sondas aqui nessa criação eu

estou mostrando uma delas essa aqui é a sonda que é complementar a quem ao alelo t ou seja ela não é complementar ao alelo que tem essa pessoa que que tem essa mostra então quando a a essa sonda ela for fazer a ligação ela não vai comprar complementariedade ela não vai se ligar só não se liga então a sonda que tem o repórter verde que por sua vez tem é um nucleotídeo a que por sua vez é complementar ao tek por sua vez está relacionada à esportes de resistência ela não vai se ligar quando uma

pessoa quando a mostra foi um homozigoto por selma simplesmente vai se ligar e não vai acontecer nada com ela mas a outra sonda vai aqui tem a e aqui ela vai se ligar e quem tem a guanina tá tem complementaridade quem tem você e por sua vez tem a fluorescência azul é a pessoa aí vai acontecer a dna polimerase vai quebrar essa sonda e vai gerar fluorescência chegou a fluorescência azul então se você faz uma reação de pcr em tempo real você não sabe qual que é a amostra que você tá na lizando aqui no

caso é no nosso exemplo você não sabe se aquela pessoa ela é homozigota para você umas gotas para o ter ou se ela heterozigoto mas você vê no final da reação a geração de fluorescência se você viu que naquele turbo o equipamento detector simplesmente a presença de fluorescência azul significa que ela é homozigota para você só teve a fluorescência azul somente a sonda com guanina que é equivalente que a complementar as usinas ela foi utilizada foi quebrada então aquele indivíduo ele é homozigoto para você é a mesma coisa acontece quando for uma pessoa a nossa

de volta para o tempo latina só que quem não vai se ligar agora é justamente a sonda que tem a guanina e que tem um floral fundo azul quem se liga é quem tem a adenina e o próprio verde tá pensar em vai acontecer aqui só que a fluorescência que vai ser gerada para quem o zigoto por ter vai se ver disso jaqueline tubo para gerar flor essência verde somente e quando indivíduo heterozigoto as duas ondas vão se ligar aquele indivíduo ele tem tanto ser como o ter ele é heterozigoto ele tem os dois então

as duas ondas as ondas que tem um g e assunto que tem lá a sonda que brilho azul e a sonda que milho verde vai se ligar vão se ligar e ambos vão gerar fluorescência tô naquele tu vai ter geração de fluorescência tanto azul como a fluorescência verde a gente fosse olhar isso aqui num gráfico né de um purificação seria mais ou menos aqui assim oh vamos iguatu para você e a ter a geração de fluorescência azul mas não ia ter a fluorescência verde um homozigoto para o ter e até a fluorescência verde mas não

teria azul o goto teria fluorescência dos dois tanto do século tem o você no gráfico de pcr em tempo real você pode ver os dados assim você pode vir dados assim também que o próprio equipamento ele caracteriza ele agrupa né os fenótipos genótipos diferentes então aqui os homozigotos e heterozigotos homozigoto para outro leva que tá com cor diferente que é um dado real que eu peguei que veio de um equipamento e as amostras negativas né com os controles negativos tem uma duas três lados aqui mas você consegue ver bonitinho lá no final de uma reação

os diferentes genótipos e aí dá para ver obviamente também formato de tabela aqui os homozigotos para um homozigoto para o outro os heterozigotos os controles negativos estão dá para ver que tudo bonitinho é assim que foi faz a genotipagem então porção gastar que não é dessa maneira que a utilizando dois primers e duas ondas uma sonda específica a cada um dos alelos que se diferencia um a congelar tipo do outro só que existe outras mas fazer isso também gerando fluorescente também já não foram essências diferentes cores também e eu vou mostrar aqui um exemplo que

a utilização de primers modificados ao sistema diferente ele não tem a ver com o sistema tacna ele diferente eu vou mostrar eu vou mostrar um exemplo que é o do casp só que existem outras variações de isso que eu vou mostrar tá é só que são variações é a ideia semelhante a ideia é semelhante você entender isso daqui você vai entender como funciona mais ou menos aí nos outros casos então vamos lá como é que funciona esse daqui primeira coisa de tudo é que quem faz a discriminação do alelo nesse caso são os primers e

não uma sonda não é a sonda diferente lado tá cama quem discrimina o alelo é a própria sonda né que ela é específica acontecer com específico alelo x ou o alelo y aqui no caso é o próprio primer que tem uma sequência diferente então primer ford acho que é o forte não liga nem o forte o primer ford o sistema aqui é ele que discrimina o alelo então você precisa de 2 primer force from diplóide né como exemplo que eu mostrei você precisa de dois primers ford um que é específica um alelo outro que específico

a outra lela e um timer reverse que é um time normal ele não é língua discriminado ele simplesmente um primer específico ao alvo mas ele não discrimina nada então primeiro ford dois primeiro fortes única específico o alelo a aqui no caso e o outro que específico alelos e aqui é outra sequência tá porque eu peguei isso aqui direto lá do do protocolo deles do vídeo de demonstração deles então não é não é mais o exemplo do velocista aqui mas é a esse aqui no caso bom então primo que se liga lá o outro primer que

se liga você só que esse grupo é minha reversa igual ele não muda né um forma convencional não tem nada de frente só que o primeiro ford que é o que faz a discriminação além dele ter a sequência de primer normal dele como se desenha em qualquer um dos primers ele tem uma caldinha mais cada um deles tem uma calda mais essa calda ela tem uma sequência específica o primer que tem o ar que descrimina a adenina tem uma caldinha mais uma sequência extra de nucleotídeo que não é complementar ao ao vocês vão ver isso

já já e ela tem uma sequência específica que nós estamos chamando de x ao outro para que a sequência será que essa parte é complementar ao alvo e ela tem uma calda mais que não é complementar ao algo que a gente tá chamando de gripe tá é aqui não tem flor off não tem nada são simplesmente pai mais modificados com essa calda extra aqui paralela os primers existem essas duas esses esses dois olhos não que eu tiro de dupla fita que tá eu não posso chamar de som daqui não é bem uma som mas assim

é semelhante a uma sonda que a gente não precisa olhar para eles com calma agora não que vocês vão entender esse daqui a pouco lá na frente mais um que é chamado de xx ele carrega o floral fundo azul e o y que carrega um flor ó por aqui avermelhado vai no chão fala e vermelho essa esse flor copo assim como acontece lá no taqman quando ele está intacta do jeito que vocês estão vendo se ajeitar dupla fita a fluorescência dele não vai para o meio porque existe também associado justamente no fragmento tinho no o

único nucleotídeo associado a ele uma molécula corrente o que faz aquela troca de energia que mostrei para vocês então quando esse essa sondinha que vão chamada de sonda vai dando essa sonda aqui ela tá é dupla fita assim associada com o seu cliente não ter geração de florescência e aqui também não tem relação a fluorescência e aí depois vem a amostra de dna o resto tudo igual nucleotídeo do dna polimerase o pão e assim vai tá vamo entender como que esse grupo de regência aqui funciona lembrando que nós estamos falando de aqui no caso um

organismo diploide alguns alguns organismos tem a outros tens então nós temos o alelo a e o alelo c aqui nesse no primeiro exemplo que eu vou dar para vocês nós estamos falando de um homozigoto para o ar então o dna dupla fita dele é ats é de um dos seus cromossomos homólogos e o seu outro cromossomo homólogo também é até porque ele é homozigoto para o ar eu vou mostrar só de uma fita para não ter que mostrar as duas ao mesmo tempo aqui que eu tô mostrando uma um dos cromossomos homólogos sol até porque

o que acontecer com essa dupla fita aqui só que eu mando pela fita que tá aberta já tá vai acontecer com essa dupla fita aqui também exatamente mesmo jeito não preciso mostrar para os dois vamos olhar só para uma então começou a pc morar com ela tá desnaturada é a fita que tinha o ácido natura da frente que tinha o tempo e aí vem a ligação tu vai vir primeiro na tentativa daquele primer que ele é específico aos e estão sendo específico você até que uma parte dele que se liga aqui assim como acontecer lá

na sonda taqman mas existe uma outra parte que não se liga que é justamente a onde deveria ter uma adenina que tem um ar não tem um ser uma citosina não vai se ligar ele vai ficar dessa maneira a dna polimerase a hora que ela encontra-se estrutura aqui ela não consegue adicionar aos núcleos de maneira complementar porque é justamente está extremidade de três linha aqui tem um nucleotídeo que não está incorporado então ela não continua adicionando que eu digitam mesmo que haja essa ligação aqui inespecífica não tem a formação de novas fibras só que nós

temos o outro primeiro o outro painel é forte que ele é 100 porcento complementar a este alelo e além dele ser 100% complementar essa ela não tem a sal calda extra aqui que não se liga ela não é complementar ao alvo ela é adicionada artificialmente ela foi adicionar e aqui no primer e ela não se liga só que a daniela polimerase ela consegue se ligar aqui formando uma nova fita ela vai formar a nova fita aqui e o outro pai me reversa ele é convencional ele não tem nada diferente eles simplesmente específica ou ao mas

ele não tem nada de muito diferente então a dna polimerase agora vai formar nova fita que a dna polimerase vai formar a nova fita aqui ah tá aqui tudo certo para a reação acontecer e aí formou os duas novas fitas terminamos o primeiro passo da pcr agora a gente vai olhar para o que vai acontecer no segundo passo somente vai olhar para este fragmento que foi formado esse fragmento que foi formado aqui não tem nada de especial nele por enquanto né ele é simplesmente um produto pcr só que esse aqui ele tem um negócio diferente

porque ele tem agora a fita que foi gerada a fita que foi produzida sintetizada lá pela dna polimerase ela tem uma calda extra que um fragmento extra mais que foi adicionado vamos olhar só para esse fragmento agora que ele tá aqui então ele foi de naturado aquela calda de aquela calda extra que foi colocada ataque na fita de cima que foi de naturado outra fita é a né original um prime revest vai se ligar aqui exatamente como eu mostrei anteriormente nada especial e um primer ford vai se ligar aqui de novo adicionando mais uma calda

mais uma calda daquela lá exatamente como aconteceu no o interior e aí as duas fitas vão ser formadas o que aconteceu de diferente aqui agora a diferença que quando a dna polimerase começou incorporar nucleotídeo aqui ela incorporou nucleotídeo de maneira complementar a calda extra que foi adicionada a minha aquela calda x que foi adicionada tem umas formamos uma fita aqui que tem a calda x que é complementar a calda x bom e é esse fragmento que eu tô mostrando para vocês tá então aconteceu aqui amplificou gerou esses dois vou molhar só para esse aqui em

cima esse aqui de cima lá no 3º ciclo da pcr agora que que vai acontecer ele vai ser naturado só que olha só quando ele é de naturado quem que se liga aqui justamente aquelas onda que era dupla fita que eu mostrei para vocês lá atrás quando ela era a dupla fita lá estava ligado ao cliente né e agora ao longo da pcr aquela dupla fita também foi desnaturada porque ela também está ali na reação quando nós colocamos ajustamos a temperatura aqui para temperatura de anelamento esse fragmento aqui da sonda ela não se liga mais

de volta som dela se liga agora algo ao complemento dela ao fragmento específico ela que foi adicionado artificialmente por conta daquela calda x adicionada lá no primer utilizado no começo da pcr agora esse é que ele é específico complementar a calda x vai ser utilizado para a formação da nova fita e aqui vai acontecer apesar condicional na fita de cima nada mundo acontece a pessoa em tempo real a única coisa que vai amplificar também a calda x e agora aquilo que mudou é que foi utilizado como primer justamente aquelas onda que antes estava associada dupla

fita ao corrente agora agora não está mais e quem tá agora que ela está distante do que encher tem a geração de fluorescência então foi formado uma fita de maneira específica quando o alelo t estava presente né isso aconteceu quando os só tinha o alelo t presente e nessa fluorescência ela vai para o meio agora porque ela não está mais próxima ao seu cliente e aí esse processo que eu acabei de mostrar para vocês vai se repetir várias e várias e várias vezes gerando fluorescência específica aquele alelo que no caso era o alelo t né

o pa ele é tão somente a fluorescência referente ao alelo t a vai vai brilhar aqui nesse caso que vieram homozigoto para esse alelo quando ele é um heterozigoto a ideia é a mesma só que além de ligar o primer que é específico para o te que tem o azinho aí que a calda x vai se ligar o outro primeiro também que é específico para o g que tem as eu cortei nucletideos e que ele tem uma outra calda aqui é a calda y e a calda y ela é complementar a outras onda que tem

a outra cor e aí nesse caso aqui vai brilhar a flor copo de duas cores o da cauda y que é do alelo g c e o da cauda x que é complementar ao alelo ats e aí é a mesma dela do seu ataque você ver as flores ensino gerada se for só azul é um alelo é uma música do outro por um alelo se for só o vermelho é um zigoto e se for azul e vermelho ele é heterozigoto assim que funciona é assim que se faz a genotipagem de snipers por pcr em tempo

real então como esse caso aqui nesse último caso eu dei um exemplo desse tem algumas variações dessa metodologia aqui mais raciocínio porta vocês entenderam raciocínio se vocês se depararem com uma outra técnica é só pegar é em esse entendimento aqui e que vocês podem extrapolar e para outros casos agora algumas dicas para quem vai fazer isso na prática tá quem tá aí trabalhando principalmente quem tá trabalhando com o som da tá com os dois sistemas aqui mas principalmente para quem tá namorando com o som da tagima e quando você vai fazer genotipagem o seu objetivo

o seu objetivo é criar condições a linha associações a sua morte certa para facilitar a vida do algoritmo de análise por que que que facilita a vida de algoritmo de análise porque quando você faz essa análise que eu mostrei para você e era florescente de uma coruja era da outra gerar as duas o equipamento ele vai capturar essa informação vai passar essa informação para um só filho só sofre vai interpretar e ele vai te falar o isso aqui é uma mousse goto por um esse aqui é homozigoto por dois isso aqui é um heterozigoto ele

mesmo já te falar isso é baseada né na fluorescência aquele identificar em cada uma das amostras em cada um dos pocinhos só que para você ter uma fluorescência uma discriminação muito evidente de fluorescência e dessa maneira fazer com que o software consiga interpretar aquilo aquela avaliação de florescente uma maneira mais adequada e por sua vez se dá um resultado mais adequado tem algumas coisas que você pode fazer então por exemplo a trabalhar com concentração homogênea de dna entre as amostras se você tiver trabalha a 120 amostra geralmente quem trabalha com genotipagem vinícius disney que trabalha

com muita moça é trabalhando com um monte de almoça homogeniza as condições de estação de quantidade daquela mostra e seus vende pureza também para que todas as amostras elas gerem fluorescência de uma maneira mais ou menos homogênea ainda que seja uma fluorescência azul uma vez sei lá o quê criança ela gera inflorescência com intensidade semelhante com a homogeneidade mais ou menos entre elas dessa maneira facilita o processo de clusterização de genotipagem em si lá através da fluorescência sempre colocar negativo porque o algoritmo dos equipamentos eles utilizam a ausência de fluorescência para falar com aquele alça

de fluorescência ele calibra aquela informação baseada em negativo e calibre aquela informação baseada em controle não outro em controle positivo então se você tiver é um exemplo um exemplar de cada um dos genótipos um homozigoto o zigoto por 21 heterozigoto você pode colocar esses controles positivos você pode informar para equipamento que aquilo são controles positivos que aquele ao genótipo x y z e essa informação vai ser utilizada no momento da clusterização no momento da agenda os pais do equipamento utilizar o master mix adequado para a genotipagem porque existem variações de configuração do master mix algumas

configurações ali dos seus reagentes em excesso os componentes favorecem esse processo que que eu acabei de explicar para vocês que vocês podem fazer também se tiver difícil de que os utilizar se o equipamento de ver com dificuldade de identificar os genótipos aumentar de 40 para 50 ciclos lá na pcr e ainda se estiver difícil pode aumentar o tempo de extensão é né lamento passar de 60 segundos para 90 segundos por exemplo que aí você tem de aumentar a taxa de clusterização das amostras que a gente consegue fazer com isso né com genotipagem disney ele falou

um pouco de aplicação lá no começo mas aqui ó para ficar bem claro para você é como uma técnica muito versátil ela tem ela traz muita informação até a capacidade de gerar muito a formação aplicada ela é utilizada em diferentes áreas olha só lá na parte de pesquisa ainda né carinho a parte menos aplicada lá na pesquisa clínica por eles são os estudos de associação lembra aquela segunda fase que eu falei para vocês nesse processo todos é a fase de sequenciamento aface associação e depois a fase de uso em rotina na pesquisa clínica ela está

muito relacionada essa fase associação né que a ligação de uma mais snap a uma característica de relevância comercial clínica sei lá o quê então existe a fase de pesquisa também mais lá na outra ponta já na rotina utilizar isso aqui para diagnóstico de doença por exemplo caso do brca1 ou e dois lá é uma informação de aplicação direta no mercado clínico no ambiente de saúde você pode associar associar a presença de um snap a probidade desenvolver uma certa doença por exemplo o desenho para tudo câncer mas existem outras várias que pode ser podem ser diagnosticadas

por esse tipo de teste ou ser utilizado um como diagnóstico companhia também ainda você tem um diagnóstico o principal feito por uma outra técnica sei lá o quê ea técnica de biologia molecular a genotipagem disney por exemplo precisar em tempo real ser um diagnóstico extra que auxilia o diego e o diagnóstico principal aí utilizado por exemplo bastante medicina personalizada em escolha da droga adequada para determinar o tratamento de câncer e assim por diante no agronegócio também é bastante utilizada é ele já é utilizado há bastante tempo então no melhoramento genético no melhoramento genético assistido por

marcadores moleculares de plantas e animais então você utiliza a informação genética informação genômica de um determinado indivíduo para auxiliar um processo de melhoramento genético por exemplo tão selecionar os reprodutores que o maior probabilidades vou ver se lá vacas maiores mais produtoras de leite assim por diante em algum exemplo aqui ou é um negócio que que tá já foi muito comum de fora do país agora tá ficando mais forte aqui no brasil que são os testes de tc ou direct com ciúme só que ele espécies que você pode comprar e ele ligar no laboratório que oferece

teste compra que ele te traz alguma informação por exemplo teste de ancestralidade que tá bem comum é como se testes recebe um senhor na sua casa sei lá onde você quiser um só a vizinho passa na boca envia esse sobe de volta o laboratório ele vai te dar informações de ancestralidade por exemplo ou informações relacionadas à saúde e ao bem-estar ou predisposição à atividade de força resistência como causa esporte ou nutrigenômica farmacodinâmica todo todos esses testes são testes direto ao consumidor que você sem a presença de um médico ou sem de um especialista da saúde

você pode comprar esse teste e você recebe o resultado que você mesmo pode interpretar pode ler e utilizar aquilo na sua vida então são teste bem interessante oi e para finalizar aqui um resumão tão snipper a substituição de um único nucleotídeo que está em maior mais de um por cento uma população ele tem a população esses depois eles podem ser a causa direta lá daquela característica do fenótipo ou estarem relacionados a característica interessante ele está associada a ele foi estatisticamente associado presente do snip quando isso não é característica podem ser identificados por diferentes técnicas de

biologia molecular em várias técnicas podem fazer a janta em paz a gente falou que da pcr em tempo real por quê porque ela técnica de fácil acesso ela é simples tem um bom custo-benefício assim por diante primas modificados ou sondas específicas aos diferentes alex podem ser utilizados no processo de discriminação elétrica que foi que eu mostrei pra vocês e há muitas aplicações baseadas na chamam de parsnips que ele falou agora rapidamente mas que teve impacto direto e indireto aí na vida de todas as pessoas certo então essa foi a aula de hoje muito obrigado por

vocês assistirem até e botar agora valeu demais e não se esqueça de me seguir aí nas redes sociais a gente se vê no próximo vídeo tchau tchau tchau e aí e aí