# Zero - CURSO HPLC UPLC UHPLC aula animação de cromatografia líquida.

[Música] olá o objetivo deste vídeo animação é discutir os princípios da técnica conhecida como h e alice de high performance lake de que matou ou em português clai de cromatografia líquida de alta eficiência um outro ponto hoje também muito discutido quando se fala em cromatografia líquida é o termo um pl se oo hplc pois bem esse termo um plc derivado aí de ultra performance lei cromatógrafo será também discutido ao longo da animação a primeira pergunta que se faz quando no entendimento da htc é por que usar esta técnica de análise imagine que você tenha uma

solução contendo uma espécie a e que esta espécie a seja então a cafeína se essa solução é submetido a um espectrofotômetro é possível a obtenção de um gráfico de absorção de radiação em função do comprimento de onda e esse gráfico característico aí da espécie pode ser utilizado então para determinação por exemplo da concentração de cafeína nesta mostra submetida à análise imagine agora que ao invés de cafeína você possui uma solução que contenha para acertar mo esta espécie química também absorve radiação uv ou seja pode ser determinada também por espectrofotometria então se eu submeter esta solução

há um espectrofotômetro eu poderei obter ou espectro de absorção deste hálito ou em um dado comprimento de onda fixo a concentração dessa espécie na solução desde que eu a comparecer com alguns padrões de concentração conhecida [Música] [Música] agora isso ao invés de eu ter duas soluções distintas eu tiver apenas uma solução contendo os dois analíticos um destes a cafeína que possuem espectro de absorção característico e outro o paracetamol que também possui o seu respectivo espectro de absorção o v biffi o gráfico resultante desta medida nada mais é do que a soma das redes urbanas de

cada espécie em função do comprimento de onda é claro que com o auxílio de alguns métodos matemáticos ainda é possível determinar a concentração das duas espécies nesta solução por espectrofotometria esta tarefa porém não é tão simples nem tão precisa quanto à determinação em uma solução onde a única espécie que apresenta sinal é a espécie de interesse e isso se torna ainda mais difícil quando o número de espécies presentes em solução aumenta basta imaginar por exemplo uma amostra de sangue onde inúmeras espécies estão presentes em uma mesma matriz em resumo a presença de outras espécies em

solução pode causar interferência e dificultar o processo de medida um método muito comum para a separação de misturas é a cromatografia líquida talvez você já tenha alguns deste tipo de cromatografia e sendo realizada em placas neste exemplo eu apresento a vocês uma tomografia líquida em coluna onde o que se faz é preencher esta coluna como por exemplo se lica este preenchimento permanece fixo no interior do tubo e recebe o nome então que fase estacionária através dessa fase estacionária faça então passar um solvente neste exemplo o que faz com que o solvente flua através da coluna

é simplesmente a força da gravidade quando uma mostra contendo os analistas é injetada no topo da coluna o solvente que através dessa coluna arrasta os alimentos e faz com que eles saiam na parte inferior de tudo agora quanto maior afinidade desses alimentos filassi lica ou seja pela fase estacionária maior o tempo que eles levaram para sair da coluna neste exemplo a fase estacionária composta de sílica é uma fase estacionária popular o que resulta então em maior afinidade paraná litos também bolaris outro parâmetro que possui influência sobre o tempo de eleição dos alimentos é a fase

móvel ou seja o solvente que é utilizado como os analistas que são separados neste tipo de fase estacionária são espécies bolaris quanto maior a popularidade da fase móvel mais rápido este selo irão através da coluna em cromatografia com sílica como fase estacionária a fase móvel é sempre menos polar ea fase estacionária o termo cromatografia ênfase normal é utilizada então para denominá lá uma vez que as espécies foram separadas é possível uso de frascos diferentes para a coleta de cada uma das relações contendo os analisou é possível recorrer se ao uso de um espectrofotômetro conectado ao

fim da coluna então o que se faz é selecionar um comprimento de onda fixo no espectrofotômetro e não mais registrar o sinal de absorvente ásia e em função do comprimento de onda mas sim em função do tempo assim o sinal registrado é pilotado em um gráfico como mostrado à direita uma vez que a mostra é injetada no topo da coluna inicia-se o registro do sinal podemos perceber que no início da separação apenas fase móvel passa pelo caminho ótico ou seja ela região do tubo onde está sendo feita a medida por isso obtém se uma linha

reta e é de regra sinalizando baixa absorção do solvente e constante em função do tempo essa linha reta ou esse sinal constante esse é o nome de minha base e é possível verificar por esta linha base ruídos provenientes do equipamento como um todo por exemplo da rede elétrica ou de variações no final do próprio detector além da linha base este gráfico deverá apresentar também variações na forma de um transe em ti ou 1 e toda vez que uma incidência de absorver a radiação selecionada face pelo detector então assim que a primeira espécie deixar a coluna

e passar pelo caminho óptico espera-se um transe em ti ou um pico em tempo de registro o tempo de separação característico desta espécie quando a espécie deixa a região de detecção ela deixa de absorver radiação e o sinal retorna a linha base como nesse exemplo temos duas espécies químicas que absorvem a radiação sendo separadas devemos ter então dois picos sendo detectado o interessante é que se mantidas todas as condições de análise e sim exatamente a mesma mostra injetada na coluna iremos obter um gráfico exatamente igual ao que foi apresentado a vocês ou seja os bicos

irão sair sempre com o mesmo tempo de análise chamado aí o tempo de retenção o tempo de eleição ea altura ou intensidade dos pixls será também mantém agora uma solução ou uma mostra com maior concentração destes analitos é injetada obteremos dois picos com os mesmos tempos de luz são apresentados neste gráfico porém a intensidade ea área desses ricos serão aumentados proporcionalmente ao aumento de concentração essas características são de grande importância para a química analítica porque a avaliação de um sinal e um dado tempo de análise pode ser utilizada para inferir sobre a presença ou não

de um dado no hálito em solução já o fato da intensidade do pico ser proporcional à concentração pode ser utilizado então para fins quantitativos ou seja para dizer quanto desse dado à lito a na mostra essas separações podem ser manipuladas pela troca do solvente em cromatografia de fase normal por exemplo quanto maior a polaridade da fase móvel mais rápido as espécies evoluíram através da coluna outro fator que possui influência sobre o tempo de eleição das espécies é a vazão da fase móvel adicionalmente é possível ainda alteração da fase estacionária utilizada na coluna apesar de mais

burocrática permite alterações significativas em uma separação a verdade é que este tipo de coluna é utilizada apenas para fins preparativos ou seja esta montagem experimental com espectrofotômetro conectada a uma coluna de vidro foi utilizada aqui apenas como exemplo didático e não é utilizada na prática em química analítica os motivos para que essa montagem com espectrofotômetro conectado a uma coluna de vidro não seja utilizada inclui alta e reprodutibilidade e baixa eficiência de separação essa baixa eficiência se dá principalmente pelo pouco contato que ocorre entre a fase estacionária e os analytics solubilizado na fase móvel para que

a fase móvel possa fluir pela coluna apenas propelida pela força da gravidade é necessário que partículas relativamente grandes e o compactadas sejam utilizadas estas partículas apesar de muitas vezes possuírem horus apresentam reduzida a área superficial assim quando o líquido através da coluna há pouco contato entre as fases devido a estes fatores e ao fato destas partículas apresentar em superfícies irregulares é muito comum a redução do diâmetro das partículas utilizadas em cromatografia com isso melhor contato entre as fases ocorre ea separação também é melhorada em hplc é comum o uso de partículas com diâmetro entre 5

e 10 micrômetros com esse diâmetro reduzido de partículas e com maior compactação o método alcança uma alta eficiência e é justamente por isso que o termo cromatografia líquida de alta eficiência é utilizado partículas menores são também utilizadas sendo comum uso de colunas com partículas menores que dois micro metros isso resulta então em um método ainda mais eficiente que o hpsc neste caso denominado de uhhh lcd ultra performance líquido cromatográficos o problema é que utilizando apenas a força da gravidade é impossível fazer passar fase imóvel por uma coluna ímpar cotada com partículas destes diâmetros o que

você vai precisar então é de uma bomba de líquidos que seja capaz de exercer a alta pressão sobre a coluna e é justamente por isso que o termo hplc de high performance é muitas das vezes substituído por ray creche o mesmo acontece com o plc sendo muitas vezes utilizado como sinônimo o termo ultra pré show em hplc é comum os equipamentos atingirem pressões da ordem de 400 atmosferas já em o plc eles podem chegar a mais de 1.000 atm para suportar estas pressões é comum uso de tubos de aço para o desenvolvimento das colunas de

separação as colunas possuem tamanhos variados dependendo da aplicação desejada as mais utilizadas possui diâmetro interno entre 2 e 5 milímetros o comprimento costuma variar entre 5 e 25 centímetros e na maioria das aplicações analíticas estas colunas são preenchidas com partículas de diâmetros entre 1.8 e 5 micrômetros quanto aos tipos de fase estacionária utilizadas a sílica pura com separação baseada em processo de absorção dos analistas sobre este sólido é pouco presente já fase estacionária denominada dc 18 é de longe a mais empregadas este tipo de fase estacionária consiste em partículas de sílica cuja superfície é ligada

a um líquido orgânico neste caso o hidrocarboneto com 18 carbono de extensão idealmente as partículas de sílica serve apenas de suporte para o líquidos e 18 que para evitar lixiviação é quimicamente ligado à superfície da sílica resumindo durante a separação com seu 18 e os analistas devem interagir apenas com líquidos sobre as partículas desse porte o que resulta então em uma cromatografia de partição entre uma fase móvel líquida e uma fase estacionária também líquida como esta cadeia de 18 carbonos é extremamente a pular utiliza-se sempre fazem móvel mais popular ea estacionária durante as separações assim

ocorre o inverso do observado na cromatografia ênfase normal com sílica como fase estacionária devido a isso separações realizadas neste tipo de coluna são denominadas de separações ênfase diversa preenchido tudo com a fase estacionária conectores são adicionados às extremidades da coluna para permitir a junção com os tubos que transporta uma fase móvel por fim indicações sobre o sentido do fluxo são adicionadas assim como dados do fabricante da coluna e o tipo de fase estacionária empregada após estas ações a coluna está então pronta para o uso na imagem apresentada é possível a visualização de algumas colunas utilizadas

em laboratórios para melhor entendimento o recheio de uma destas colunas foi removido e é apresentado também a vocês na imagem [Música] para colunas com partículas de 5 micrômetros é comum o ajuste de vazão da fase móvel para valores próximos a 1 ml por minuto além de permitir o controle via software alguns equipamentos apresentam painel de controle manual indicadores de vazão e pressão na própria bomba tanto na saída como na entrada de líquido destas bombas válvulas mecânicas do tip cheque waltz estão presentes estas válvulas servem para garantir que o fluxo de solvente ocorra em apenas um

dos sentidos pode parecer de pouca importância a reconhecer a presença dessas aulas no sistema de hplc mas é preciso citar que muitas das vezes em que a bomba de alta pressão deixa de funcionar a remoção e limpeza dessas obras é o suficiente para resolver o problema os pistões e selos que compõem a bomba são outros pontos que costumam apresentar problemas o mais comum é a entrada de bolhas de ar nos pistões o que pode ser resolvido simplesmente pela realização de uma purga ou em casos mais difíceis há de se acionar a bomba e realizar sucção

das bolhas de ar com uma seringa conectada à tubulação de pulga a válvula de burca é o dispositivo que permite estas operações quando deseja se a limpeza da bomba a válvula é manualmente aberta o que permite então o direcionamento da fase móvel não mais para a coluna mas sim para um tubo de descarte devido à alta pressão necessária para transpor a coluna é comum o uso de tubulação de aço para saída da bomba já a sua entrada é conectada por uma tubulação polimérica a um reservatório contendo a fase móvel em colunas e 18 as fases

móveis mais utilizadas são compostas por uma fase aquosa às vezes as identificada ou de campo nada metanol acerto entre lá e e hf o mais comum é ajustar uma fase móvel que seja composta por uma mistura de dois ou três desses solventes e que permita a separação das espécies desejadas para que seja possível a injeção da mostra de forma reprodutível o injetor é conectado entre a saída da bomba ea entrada da coluna de separação este gestor possui duas distintas posições uma para amostragem e uma outra para a injeção da mostra na coluna a amostragem de

volume definido e reprodutível por este setor é concebida pelo uso de uma alça ou não pedir amostragem conectada na parte traseira do injetor este tipo de alça pode ser adquirida ou confeccionada com o volume desejado em hplc para fins quantitativos é comum a alça de amostragem apresentar volumes entre 5 e 20 microlitros já eo plc devido à menor capacidade das colunas os volumes injetados são menores o carregamento de amostra neste gestor é realizado por meio de uma seringa a forma mais reprodutível de injeção consiste em utilizar volume de amostras na seringa que permita lavagem e

preenchimento total do lucro de amostra pequeno excesso de amostra é com isso descartado durante o carregamento no injetor preenchida a alça o injetor pode ser colocado na posição de injeção para introdução do clube de amostra na coluna como a bomba está ajustada para 1 ml por minuto a mostra será logo transportado até a coluna ea volta de injeção pode então ser retornada a posição de carregamento enquanto isso no interior da coluna os analistas presentes na mostra interagem de forma diferenciada com as fases estacionária imóvel e podem então ser separados um dos problemas recorrentes em htc

é que componentes por exemplo presentes na matriz da mostra podem se ligar de forma irreversível a coluna e prejudicar sua capacidade de separação estas colunas cromatográficas possuem valor considerável para que sejam descartáveis assim o que se faz é utilizar previamente a coluna de separação uma coluna com a mesma fase estacionária mas de menor tamanho e de valor reduzido esta coluna recebe o nome de coluna de guarda ou pré coluna e serve então para proteger a coluna de separação de um possível dano irreversível agora que o sistema de separação já foi apresentado é possível conectar ao

final da coluna um detector que seja sensível alguma propriedade física ou química dos analistas a saída do detector por sua vez pode ser direcionada para um outro detector ou mesmo para um frasco de descartes então durante todo o tempo a fase móvel flui através da coluna passa pela célula influxo do detector e é direcionada para o descarte este será também o caminho que os analistas percorreram após a injeção o detector mais utilizado em hplc é o detector espectrofotometria isso se dá porque muitas espécies químicas absorvem a radiação o vê por exemplo uma variedade imensa de

fármacos que apresentam anel aromático uma das configurações que pode ser utilizada nesse tipo de detector consiste de uma lâmpada que emita radiação em comprimento de onda na região do v em seguida de algum tipo de filtro para certos comprimentos de onda uma célula em flor isso é um fotodetector como a lâmpada emitir uma banda larga de radiação há necessidade de seleção do comprimento de onda o que pode ser realizado através de uma rede de difração ajustável com isso pode-se fazer com que apenas a radiação desejada passa por uma pequena fenda e atinja a célula influxo

por onde passam à fase móvel e os analistas após a série fluxo à radiação selecionada atingiu foto de dor e variações na absorvam ânsia podem ser medidas para que o equipamento apresentada vocês funcione basta agora conectado a um computador onde um software específico de controle e adição de dados esteja instalado além de permitir o registro e tratamento dos dados o software permitirá ajustar parâmetros como o comprimento de onda do detector razão e tempo de corrida escolhida fase móvel e ajustadas todas as demais condições de análise é possível então dar início à separação por meio da

injeção da mostra durante toda separação do sinal de absorvente do detector é registrado e um transe em ti na forma de um pico é detectado a cada vez que o hálito que absorve a radiação passe elas ellen fluxo se ampliarmos a região referente aos três primeiros bicos podemos ver que nesta condição hipotética todos os ricos estão separados um detalhe porém de grande importância e separações por hplc é que a separação das espécies não é tão simples assim de se conseguir é muito comum no início do desenvolvimento de um método e as espécies que ficam pouco

retidas na coluna não sejam bem separadas na verdade muitas das vezes elas podem apresentar praticamente apenas um único pico sempre uma separação uma das estratégias utilizadas para permitir que estas espécies interajam mais com a coluna é reduzir a força da fase móvel utilizando uma fase móvel onde estes analitos sejam menos solúveis possibilita-se que eles interajam mais com a coluna e com isso haja maior chance de separação ênfase reversa se a fase móvel é composta de etanol e água pode se reduzir a força do solvente pelo aumento da proporção da fase a cosa testando se algumas

misturas com proporções diferentes muitas das vezes consegue-se uma separação adequada outras vezes no entanto há de se alterar o solvente utilizado o ph do meio ou mesmo a coluna utilizada para a separação agora é preciso citar que esse hplc que estou apresentando a vocês é um dos modelos mais simples disponíveis comercialmente permite o uso apenas de uma fase móvel com composição fixa durante toda a corrida ou como chamado em cromatografia permite apenas o uso de separações em modo isopor ático durante o time zação de um método de separação é comum a avaliação de diversas misturas

de solventes como fase móvel se um equipamento destes é empregado haverá necessidade então de preparo de uma nova fase móvel para cada teste realizado o que sem dúvidas é pouco produtivo adicionalmente com esse equipamento simples mesmo quando a separação é conseguida baixando-se a força da fase móvel o outro problema surge com a baixa força e lente do solvente espécies de baixo interação com a coluna podem até servir de separadas porém espécies que com sua interação e diana com a coluna podem levar mais de uma hora para sair já uma espécie de alta interação com a

coluna pode até mesmo não ser detectada esse problema ou problema geral da eleição é resolvido com uma separação dinâmica e nominado então de modo gradiente a separação é iniciada com o solvente de baixa força e que permita a separação das espécies - retidas porém durante a corrida a composição do sorvete é alterada de modo a acelerar a saída das espécies que apresentam maior interação com a coluna para que isso seja realizado é necessário que o equipamento apresente alguns outros componentes a necessidade por exemplo de maior número de reservatórios para os solventes podemos ter agora um

reservatório para fazer a cosa eu outro para um solvente orgânico como o metanol ou acerto entre la a bomba de alta pressão pode ser conectada esses reservatórios de fase móvel por meio de uma válvula controlada eletronicamente e que permita aspiração hora do solvente a hora do solvente b é comum equipamentos com válvulas para a seleção de até quatro canais diferentes ou seja permite a mistura e até 4 solventes para concluir a fase móvel nestes sistemas a mistura feita pelo próprio equipamento e não é mais necessário o preparo de uma nova fase móvel para cada teste

realizado outro ponto de grande importância é a possibilidade de ajuste da proporção dos solventes de forma fácil e dinâmica mesmo durante as separações esse modo é chamado de gradiente de baixa pressão vez que a mistura do solvente realizada antes da bomba a região do sistema onde a pressão ainda é próxima a atmosférica outra forma também bastante utilizada para geração de gradiente é o uso de duas bombas ligando cada uma destas bombas a um solvente diferente e ajustando se à razão destas é possível programação da proporção dos solventes a qualquer momento da corrida neste sistema de

duas bombas a mistura do solvente é feita depois das bombas e por este motivo o modo é denominado de gradiente em alta pressão então para utilizar uma fase móvel com 50% de cada solvente pasta que a vazão de ambas as bombas seja ajustada para o mesmo valor se o objetivo é uma vazão total de 1 ml por minuto cada bomba deve ser ajustada então para 0,5 ml por minuto se repetirmos a separação que foi feita utilizando o módulo socrático mas agora utilizando gradiente podemos em uma condição hipotética iniciar a separação com fase móvel composta por

30 por cento o metanol e 70% água após algum tempo suficiente para que as primeiras espécies sejam separadas a proporção de metanol passa então a ser aumentada com isso a força e lente da face móvel aumenta possibilitando acelerar a saída das espécies com maior afinidade pela coluna no final dos analisados são detectados sem que muito tempo seja necessário para a separação agora o equipamento que acabamos de montar já é um modelo bastante comercializado permite a realização de experimentos diversos sem que seja desperdiçado tempo com a preparação de número solventes ou mesmo com corridas muito longas

por fim se adicionarmos ainda um injetor automática no lugar do manual teremos agora um equipamento muito parecido a um dos que possuímos no laboratório didático do instituto de química da universidade de são paulo usp [Música]