A técnica de PCR - aula prática

o Olá seja muito bem-vindo ao universo da biologia molecular eu sou Eduardo castanho e é uma vergonha faz mais de dois anos que não tá fazendo aula aqui fizemos aulas práticas de vários temas É uma vergonha a gente não tem uma aula prática de PCR ainda tem uma aula de hoje é uma aula prática para resolver esse problema uma aula prática sobre a nossa queridinha a técnica de PCR e você vai aprender tudo saber sobre esse a gente vai fazer também seguida essa daqui uma aula de eletroforese sobrou separados a primeira vai ser de PCR

hoje só PCR na prática na bancada que fazendo tudo que precisa ser feito para você conseguir executar reação de seu laboratório e na próxima a gente faz a análise dessa PCR aqui utilizando eletroforese Beleza vou rodar vinheta não se esquece de se inscrever no canal se você gostar do vídeo Se você achar que pode é que outras pessoas podem usufruir dessa informação que compartilhem sabe o que você ajuda bastante o canal você ajuda as outras pessoas que você acaba jogando porque eu vou continuar produzindo contigo fazendo e a gente se vê Já já depois eu

ir aí e [Música] [Aplausos] [Música] [Aplausos] [Música] [Aplausos] vamos começar a falar prática sobre PCR antes eu quero agradecer América e disponibilizou tudo isso aqui que a gente tá fazendo todos os reagentes disponibilizou espaços os parceiros que ela tem para a gente conseguir gravar sala aqui então valeu demais né que por essa parceria saibam vocês que estão ajudando a disseminar o conhecimento sobre o lojão molecular vai ficar animal Olha só como ele vai funcionar sala aqui nós vamos daqui a pouco lá para o outro critório lá no outro estúdio eu vou passar na teoria que

a gente vai fazer aqui na prática né Não dá para começar a misturar unha aqui você não entender que tá fazendo o segredo de um bom biologista molecular é saber o que ele tá fazendo contato pegando Então vamos entender cada passo a gente vai fazer daqui eu vou explicar um pouco sobre esse aqui em frente tem umas características dominantes Oi e a gente volta aqui para fazer na prática certo é sim mastermix em vai utilizar os que a gente percebe que a gente vai utilizar aqui chamado de jumpstart o velho tá é a quem fazia

persegue lá atrás ao Poucos Anos Atrás provavelmente um bom problema ali para utilizar os reagentes para deixar a reação funcionando bonitinho vocês vão ver a facilidade que ia fazer uma reação hoje em dia e esse quente esse máximo que especificamente além dele são mastermix vou falar sobre isso na aula teórica além deles uma servir que ele tem algumas personalidades que vocês vão acreditar tipo você consegue pegar ele eu dei uma coloração para você saber se retou já o que a gente no cobertor que consegue pegar o produto essa pessoa e colocar direto no gel de

agarose não joga na eletroforese em gel de agarose sem precisar do buffer de carregamento você não precisa colocar a o banco de visualização de ficar é muito bom é muito bom vamos lá para o nosso outro estúdio eu vou explicar para vocês como funciona esse Master me falar um pouco sobre PCR né Master Mix e depois a gente volta faz aqui tudo na Faca uma maravilha vamos falar aqui então sobre a técnica de PCR eu vou fazer aqui uma teoria rápida para vocês mas eu não vou entrar em muitos detalhes porque porque aqui no canal

tem um vídeo completaço sobre PCR eu falo exatamente como funciona a técnica dos detalhes sobre os ingredientes sobre cada um dos ingredientes Como funciona o passo a passo dela lá então se você que está assistindo esse vídeo aqui ainda não tem os conhecimentos profundos Observe Beleza pode continuar aqui que você vai entender não é o básico você vai entender mas para você se aprofundar entender exatamente cada passo clica nesse link e eu vou deixar aqui em cima na sala que eu vou deixar aqui em cima e assistir aula completa lá certo hoje aqui a gente

vai falar sobre o básico da pressão e vamos ver o protocolo que a gente vai fazer lá na prática PCR a mãe de todas as técnicas de PCR O que é uma sigla né que vem do inglês polymerase chain reaction a reação que acontece em Cadeia baseado em uma enzima chamada polimerase Reação em Cadeia da polimerase ela é o control c control V da biologia molecular a gente consegue mas não dava control c control V no um texto é vai lá no texto do Word Por exemplo selecione da contra você mas na outra parte preço

da conta ver copio eu copiou e colou o texto a na PCR meio da biologia molecular eo racional mesmo só que vejo a gente copiar e colar texto está colando copiando e colando fragmento de DNA são fragmentos específicos e ganhar que a gente que analisado até que estar observar alguma coisa a gente tem ali que nos interessa nem que a gente precisa copiar e colar esse fragmento fazer várias cópias e identificar essas várias cotas certo então por isso que eu falo que a pessoa é o control c control V da biologia molecular ou até mostrar

aqui nos caminhão o que que é PCR e faz né Eu imagino que você tem uma população óleo de DNA um genoma eu sei lá uma amostra coletada eu não interessa tem DNA ali no meio e dentro desse de ninhada ainda essa moto dele é existe uma porção que te interessa um fragmento ali dentro dessa população se Genoma esse uma porçãozinha ali que te interessa que eu tô no DNA que entrei aqui é o que vai te trazer alguma informação aquilo que você quer detectar aquilo que você quer quantificar alguma coisa eu tiro Então você

pega a pessoa é que uma pessoa a gente consegue pegar esse especificamente este fragmento alvo aquilo que nos interessam que eu tô mostrando aqui com o vermelhinho e a gente consegue fazer a Copa dele é a técnica utiliza este fragmento como um template com o molde para produzir uma cópia Idêntica ela introduza como template e vai lá e faz uma cobra só que a técnica não para aí ela acontece em Cadeia com eu falei atrás para você só ela vai repetir esse processo só que agora em vez de utilizar um fragmento como ela vai utilizar

os dois Ela copiou um tem dois agora ela vai pegar esses dois utilizar com mods os dois vai gerar mais um né cada um dos dois jamais um for mundo quatro no total a técnica não para aí ela vai repetir mais uma vez só que ela vai fazer o processo com quatro gerando mais quatro ela vai repetir esse processo só que agora utilizando o oito tem 38 moléculas como o áudio ela vai comprar essas outras formando 16 ela repetir esse processo só agora conversando com 16 e assim por diante ela vai repetindo ela vai utilizando

cada fragmento copiado ao longo da PCR ele serve como substrato a produção de mais cópias no ciclo seguinte nesse processo que vai acontecer um círculo gente vai viajar e aí no final a gente tem um monte de cópias do nosso cliente a partir daí a gente consegue analisar até que estar codificar sequencial que a gente quiser fazer com esse negócio em certo então a pessoa ela funciona assim fazer cópias muitas e muitas cópias de um fragmento de ganhar não é um fragmento qualquer não faz muito específico aquilo que nos interessa aquilo que a gente quer

analisar E são essas duas características de fazer e de maneira exponencial e de maneira específica que fizeram da PCR a técnica popular e extremamente útil tá na ela é porque quando se trabalha com DNA trabalha com biologia molecular de uma geral aqui frente falando Mais especificamente Daniel você não importa quem trabalha com essas moléculas e tem duas grandes dificuldades né A primeira consegui identificar detectada essa molécula está fundo de molécula né tão difícil de você tem um uma um mecanismo uma técnica de detectar a presença daquela molécula a gente é difícil fazer isso só que

uma pessoa a gente consegue fazer várias e várias e várias e várias cópias de um fragmento a gente aumenta ele tem tanto a quantidade de like que a gente consegue ficar mais fácil detectar a sua presença e fica mais fácil de visualizar é assim fragmento ali na nossa mostra certo então a primeira essa e a outra a especificidade nossas fontes de DNA é uma macromolécula molécula gigantesco caso e humanos aí é um fragmento um Genoma contém três bilhões de pares de bases não é muito grande e muito raramente o interesse estudar no Genoma completo às

vezes Muito provavelmente isso dava para de mentir um gênio um pedaço de um gênero um snipper alguma coisa ali que nos interessa dentro daquela molécula Como que você consegue dentro de um negócio gigantesco selecionar aquilo que te importa a pessoa essa capacidade também fazer essa análise e específico então aumentar muito a quantidade do alvo a ser analisado e não é de qualquer coisa do almoço analisado é um tratamento específico a gente quer detectar então por isso que eu falo que a PCR ela não loucos da humanidade tudo a quase tudo a gente faz um direito

e o desenho da PCR desde a roupa que você utiliza até os teste que você faz em laboratório certo nem por isso que eu falo que mudou então o curso da humanidade mas não só da humanidade a biologia molecular também porque várias técnicas da biologia molecular A grande maioria delas utiliza pensar em seu protocolo uma aplicação da PCR certo e a PCR essa técnica centro falo isso aqui né é um quilo e é como culinária é muito parecida com culinária tão fazendo isso é como fazer um bolo você tem ali um vários ingredientes ingredientes que

você vai precisar vai ter um modo de preparo e manda ver que você consegue copiar esse fragmento de DNA de maneira exponencial específica lá receita precisar é o seguinte você vai passar dos ingredientes né vai colocar ali no ambiente vocês vão veja aqui ela aqui no caso é um tubinho pode ser uma placa aqui na aula prática gente vai utilizar um tubinho mas obviamente pra gente começar esse negócio é preciso DNA que vai se ver com template né como o molde é aquele DNA que vai ser copiado ou contém o fragmento a ser copiado ao

longo da PCR nós vamos precisar também de nucleotídeos que a unidade formadora da molécula de DNA a isso tudo em detalhes eu já expliquei na sala até a hora que você quiser saber o que é nucleotídeo os ingredientes utilizados na pessoas assistir a alta que eu fui lá para vocês uma outra analogia né se o DNA a ser formado fosse uma casa os nucleotídeos seriam os tijolinhos a gente precisa la enzima que faz que faz e como é que pega esses nucleotídeos e vai colocando ele na ordem certinha para copiar o fragmento alvo a ser

analisado aí nós temos a DNA polimerase que entra aqui também que no caso da na loja da casa é só que seria o pedreiro é quem faz ele vai formar as novas moléculas certo nós temos os primers são os fragmentos é um fragmento de DNA fita simples de que sequência específica desenhado especificamente para amplificar amplificar no contexto PCR fazer cópias para amplificar especificamente o alvo a ser analisado então é um fragmento de DNA ali por volta de 20 do que eu disse um DNA simples que vais anelar é um par né são dois primers um

par de primer por PCR cada um desses planos vai ser anelar especificamente as extremidades do alvo a ser copiado dele que da especificidade nós temos um zumbi Valente muitas vezes utiliza o cloreto de magnésio é por conta do magnésio que vai funcionar como um cofator da DNA polimerase por a reação aconteça e uma solução tampão para tamponar as condições a reação manter ali as condições estáveis o máximo possível ao longo de todo o processo e o modo de preparo vai pegar tudo isso daqui né todos esses ingredientes vai misturar tudo colocar dentro de um tubo

vai levar ao forno não forem específico especial é chamado termociclador e vai acontecer mais ou menos isso aqui né Isso Aqui varia de protocolo para colocar até o que a gente vai utilizar na prática no exatamente assim mas não importa aqui é o sol racional e vai pegar esse seu tubinho contendo todos os ingredientes e levar ao forno com 95 graus celsius temperatura alta 94 vendidos em graus celsius por um determinado tempo aqui no meu caso um minuto depois vai baixar essa temperatura é para 55 60 65 graus Celsius EA temperatura mude os primers vão

se anelar de maneira específico por um determinado tempo ali dois minutos aqui no caso depois você aumenta a temperatura novamente para 72 com determinado tempo para que a DNA polimerase as ela consiga formar as novas e fica copiar o alvo a ser copiado certo Aí você pega esses três passos aqui repete várias vezes 30 35 40 50 vezes dependendo do protocolo para que a reação aconteça em Cadeia e amplificação aconteça de maneira exponencial terminou isso Pega esse produto ou vai analisar vai ser conhecer água detectar um guarda na no menos 20 eu li que tá

tudo certo certo a reação acontece um tubo não era um tubo com esse aqui não pegar essa imagem tem um tubo maior não dá fácil é mais lá na prática eu sou eu o tubinho que a gente vai utilizar ou não uma placa né mas é algo semelhante isso daqui então a gente vai colocar as os ingredientes aqui fazer aquela variação de temperatura até nos clássico para PCR acontecer quer que eu tô mostrando aqui naqueles Três Passos 95 graus Celsius por um tempo 60 graus Celsius 55 60 graus Celsius por um outro tempo depois 72

graus Celsius por mais um determinado o tempo são os três passos principais da PCR que a de naturação anelamento dos primers e a extensão A de naturação que acontece EA 95° céu eu tô mostrando esse vídeo aqui 95 95 4 graus Celsius ela serve para separar o DNA que ele é dupla fita né estrutura do DNA ele é dupla fita para romper as pontes de hidrogênio que mantém essas duas fitas Unidas é formando aqui as duas fitas simples né Para dar o passo inicial da Ração perdi começar a fazer o processo de copa eu sou

o primeiro passo desnaturação acontece 9594 graus Celsius certo depois a gente vai baixar a temperatura para 55 60 graus Celsius nessa temperatura os primers que eu falei para vocês que aquele fragmento fita simples de DNA eles vão se ligar anelar especificamente as extremidades no Alfa a ser copiado um plano vai se ligar numa extremidade o outro Prime vai se ligar a outra extremidade e depois a gente aumente a temperatura para 72 para que a DNA polimerase comércio incorporar os nutrientes formando as novas fitas como é que ela funciona a DNA polimerase procuram nucleotide ela tem

que te É sim essa estrutura dupla fita que formada né por isso que o Primer se liga aqui meu iniciadora da reação ele que permite que a DNA polimerase se associa as extremidades aqui e venha colocando os nucleotídeos formando a nova fita ADM a polimerase ela sempre eu coloco nucleotídeo no sentido 563 linhas estão aqui austeridade cinco linhas da fita aqui a três linhas ela vai incorporando o que eu tive nesse sentido por isso que ela não incorpora para o outro lado é por isso que essa outra daniapolinariof extremidades tá colocando nesse sentido que aqui

é o cinco linha aqui é o três linhas ela vem incorporando aqui nesse sentido formando a as novas fitas e ela sempre utiliza a uma das frutas com o molde pra incorporar um pouquinho de correto né Sempre ligando aconteça é com g acontecer com g formando as duas novas fitas Então veja aqui no começo do processo em tinha começado nessa reação aqui com um fragmento depois da desnaturação do anelamento dos Primos da extensão nós finalizamos o processo em duas moléculas fizemos utilizamos utilizamos essas fitas aqui como cópia para formar a as novas dicas certa tá

aqui o círculo completo então de maturação 95 graus Celsius molécula de DNA e naturando em alta temperatura depois baixa temperatura paralelamente nos primeiros logo em seguida DNA polimerase incorporando nucleotídeo que forma específica que usamos a fita com mod acontecer com g sempre no sentido cinco linhas três linhas começamos o processo com uma fita terminamos com duas agora você vai repetir esse processo fazer exatamente a mesma coisa desses Três Passos novamente só que agora começando com dois fragmentos agora a gente tem dois aí o mesmo processo vai acontecer no jeito que eu que vocês viram e

esses dois fragmentos vão dar origem a mais dois fragmentos a gente vai começar o processo com dois fragmentos terminar com quatro a gente vai repetir o processo agora começando com 44 vão ser utilizados como mote finalizando com outra pois 8 16 há 32 32 64 e assim por diante é isso que vai acontecer certo em exatamente o que eu mostrei ali atrás que eu acabei de falar tanto de ficar só Salva eu tô tô representando aqui né Nós temos ali no começo da PCR um fragmento gente nunca começa a pensar em como um fragmento de

fato ela começa com vários fragmentos já né mas aqui já que eu tô mostrando com a gente vai começar a pessoa reconhecer um fragmento aqui esse fracamente vai ser utilizado com o molde para síntese de duas cópias idênticas o processo vai repetir cada uma dessas cópias aqui vai ser utilizado como tempero para geração de mais duas formando quatro cada uma dessas quatro aqui mais duas segunda 8 16 32 64 lá só repetindo até que lá no final da pessoa é Teoricamente você tem bilhões e bilhões de cópias do fragmento o que vai te permitir é

detectar detectar só moleque de maneira específica né porque quem foi copiado aqui foi o fragmento aula aquilo que você quer analisar detectar este processo Olá tudo atualmente acontece faz um bom tempo aquele acontece de maneira automatizado o forninho que faz a variação de temperatura que faz a ciclagem da temperatura lá nos três passos é chamado de termociclador vai cruzar tudo isso lá na aula prática antes a gente ia olhar o protocolo só quero falar um pouco aqui sobre o sistema hotstart que também é um tema que já tem aula aqui no universo deu mal vou

deixar o link mas é importante porque a gente o kit a gente vai utilizar ele tem essa essa estratégia aqui Rockstar que que acontece os primers aí eu falei para você esquecer ela 60 graus Celsius encontra-se em processo de maneira específica ao alvo e ao longo da PCR né só que os farms estão nessa nela ao alvo ou cianello a molécula de DNA quando você tem que temperaturas mais baixas só que quando você tá trabalhando com temperatura baixa temperatura ambiente por exemplo o Primer ele se ela de maneira específica ele não vai sanela exatamente o

alvo a ser copiado ele pode anelar e nele mesmo um outro pedaço do template outro por e ele faz sonela de maneira em específica como você tá em baixas temperaturas temperatura ambiente por exemplo e a DNA polimerase que acontece a extensão dela 72 graus Celsius que eu falei para você ela também funciona em baixa temperatura ela também funciona a 32 graus Celsius 25 graus celsius temperatura ambiente também ela funciona e aí que quando você tem uma situação como essa não é uma reação de PCR que você tá montando ali em temperatura ambiente não tá no

gelo ele vai acontecer o Primer vai se ligar de maneira específica montando ali né montou sua reação colocou todos os ingredientes vai preparar o termociclador para correr que que vai acontecer nesse intervalo o plano vai se ligar de madeira inespecífica uma região a lei que não que não é o alto dele a DNA polimerase vai encontrar aquela religião iniciadora e vai começar a incorporar no teu tilio formando é fragmentos inespecíficos tão pra mim se liga de maneira específica a DNA polimerase e reconhece aquele sítio de indicação ele começa a incorporar nucleotídeo de maneira inespecífica e

esses fragmentos gerados de maneira inespecífica antes da PCR eles podem eles provavelmente serão unificados ao longo da pessoa e também afinal de contas eles têm a sequência do primer né Esses foram gerados a partir do Prime que eles têm a sequência do Prime É isso aí mesmo ser amplificado Aline especificamente em conta a mesma reação de menino eficiência da reação consumindo reagente é um negócio ruim quando isso acontece Então tá aqui ó a 25 graus Celsius os primeiros eles podem se ligar de maneira inespecífica nem tem a ligação completa que a um template Ou ele

se anelar um primer Cianê lá na ele mesmo a DNA polimerase Você conhece isso incorporando o que eu tinha de formando coisa específica só que existe estratégia para você evitar que isso aconteça primeiro você pode trabalhar no gelo para abaixar a temperatura isso não acontecer mais existem DNA polimerase que é o caso da polimerase que a gente vai utilizar na aula prática são DNA polimerases bloqueadas elas vem com protetor associada a elas no nosso caso aqui vai ser muito corpo que não o que elas incorporam nucleotídeos que ela trabalha em que aquele anticorpo tiver associada

a ela Então mesmo que um primer lá você trabalha na temperatura ambiente um prima você liga de maneira inespecífica ou alvo a DNA polimerase ela não consegue encontrar no teu Tim ela só vai conseguir encontrar nucleotide depois que esse bloqueador no nosso caso que vai ser um anticorpo ele é removido ele é de naturado Isso vai acontecer no caso aqui por temperatura só vai acontecer a DNA polimerase só será desbloqueada o anticorpo só vai se desligar dela ativando a minha polimerase quando você colocar essa reação a 95 graus Celsius lá no começo da PCR se

a gente vai ver se no protocolo Aí sim ela fica funcionar começa a função e começa a trabalhar estou 25 graus Celsius da minha polímeras está conhecendo o corpo bloqueador aqui ela não funciona de maneira inespecífico Mas lá no começo da PCR a primeira coisa que vai fazer aumentar muito temperatura dessa reação para 90 a 100 graus celsius esse anjo corpo aqui vai ser desnaturado que vai Oi e a polimerase passa aplicativo funcional e a gente consegue fazer a reação agora vamos dar uma olhada no protocolo aqui rapidamente só para a gente entender exatamente que

vai ser feito lá na prática tô aqui está o protocolo a gente vai utilizar né podiam prostatite é isso é o kit que a gente vai usar o máximo que a gente vai utilizar aquele só destaque tem várias informações aqui sobre o cliente muito eu tô falando lá na prática né então não vou ficar entrando detalhes é só lembrando aqui que nós estamos fazendo pensei que utiliza a estratégia lotes Tati vamos ver o que que tem de importante aqui ó então aqui tá falando no que tá explicando dentro protocolos explicando que hotstart o mecanismo da

que vem para dentro start né com esse mastermix que previne a amplificação inespecífica de produto inespecífico então a reação pode ser montada em temperatura ambiente e ela fica estável até duas horas tranquilamente aí vocês vão ver também que o diante start ele é um master Mix que ele vem com um corante ele vem com uma coloração avermelhada é que ele tá falando e ele não é um problema se você quiser fazer uma PCR nessa nessa de PCR depois vou pegar que produz a pessoa aí para sequenciar ou fazer eletroforese esse corante ele não interfere nos

passo seguinte geralmente que você faz um todo especial inclusive tratamento com enzimas outra coisa interessante que que nós estamos falando de Master Mix eu falei para vocês ali na aula teórica agora a gente vai pegar a DNA polimerase O cloreto de magnésio a gente vai misturar tudo aqui no tubo né quando a gente trabalha com mastermix que é a opção quem tá trabalhando aqui no caso agora vários desses ingredientes ele já vem misturado e você não precisa misturar eles individualmente tem protocolo que você coloca cada um deles individualmente lá no tu mas tem protocolo que

alguém tá utilizando aqui que os ingredientes e os ingredientes comuns a reação de já vem misturado Então já tem a DNA polimerase tem cura de magnésio já tem o tampão já tem os nucleotídeos todos misturados ali pronto para gente colocar um primer específico de cada a amostra que específico de cada Experimenta um pouco de água para chegar no volume que a gente precisa além de reação daquele tá mostrando aqui cada componente presente no master Mix certo então daqui ó Eu Só Quero mostrar para vocês a isso aqui a quantidade que a gente vai colocar de

cada um dos componentes lá na reação mas eu não vou entrar em detalhes agora que a gente vai detalhar isso na prática lá na lousinha eu vou mostrar Exatamente porque de do volume de cada um desses em a gente vai utilizar lá na hora eu sou a única coisa que eu quero mostrar aqui para vocês é a a termociclagem né então aqui ó a PCR em cima é os três passos da PCR de naturação Nella mente extensão estão aqui gente vai repetir de 30 a 35 vezes desnaturação 94° seus por 30 segundos anelamento que vai

5561 dependendo da temperatura de anelamento dos primos por 30 segundos extensão por 72 dois minutos vejam que nós temos uma desnaturação inicial a chegar na ciclagem da PCR mesmo nós temos aqui uma desnaturação Inicial que vai acontecer a 94° por dois minutos essa desnaturação Inicial pra tem duas funções fazer uma de naturação mais mais agressiva do DNA porque ela vai ficar por mais tempo Líder natural 94 graus Celsius né mas ela tem a função também de ativar a DNA polimerase Renato a desnaturar a o outro corpo e ativar a enzima portanto aí depois nós temos

Essa extenção final quem vai acontecer 72 graus Celsius por cinco minutos para aumentar a Que eficiência é o rendimento da PCR depois fica quatro graus Celsius indefinidamente é simulando aqui a temperatura de geladeira para aquele fragmento ficar ali armazenado bonitinho certo é isso gente vai fazer vamos lá na prática fazer tudo isso de verdade um laboratório Pessoal vocês viram com protocolo extremamente simples é muito fácil utilizar essa é uma das vantagens de trabalhar com mastermix além de você evitar contaminação diminuir a probabilidade de erro de completar esse tipo de coisa e que tipo proporciona fazer

um trabalho muito mais fácil na bancada Só que ainda assim sendo muito simples o protocolo tem algumas coisas que as pessoas têm bastante dúvida eu recebi essas perguntas com bastante frequência que não tiver sobre o mal que é o seguinte as continhas para gente chegar aqui nas concentrações adequadas eu devo fazer essas contas aqui na lousa Agora eu preciso entender você vê que negócio Vamos sim são três passos Primeiro vamos descobrir o volume que a gente precisa apertar do nosso primeiro de cada um dos primes para chegar na concentração que o protocolo pede depois quanto

que nós vamos ter que interpretar do Nossa amostra de DNA para chegar na quantidade na concentração que o protocolo pede e depois nós vamos fazer vamos multiplicar cês vão entender nós vamos multiplicar os volumes para gente fazer um master Mix em cima e faça uma semente Então as sementes que a gente que foi comprado que alguém tá utilizando nós vamos criar um master Mix com todos aqueles ingredientes que a gente são comuns a todas as amostras vão entender exatamente que eu tô falando daqui a pouco mas vamos começar com o primeiro passo e que as

concentrações de prima quantidade de Praga quem tem que prestar na reação beleza vamos lá eu vou passar aqui para Luzia então primeiro passo a passo um ali da seguindo nosso protocolo nós queremos a determinar a descobrir qual que é a quantidade é uma quantidade o que a gente tem que pintar de cada um dos primes cada um dos primos tá lá na reação Olha só uma informação para gente conseguir fazer essas contas Assunção meu meu primer que está na solução Solução de trabalho trabalho ele está uma concentração de 10 micromolar essa concentração de trabalho dos

meus primos porque 10 mil como lá geralmente trabalha com essa com essa concentração oprime quando ele chega quando você comprar me deu feliz e eu feliz ele guarda trabalha com duas concentrações sem micromolar que a concentração de estoque daquela guardar dinheiro menos 2110 micromolar um pouco mais diluído que aquela concentração de trabalho que é o que você usa congela congela Hoje a gente vai utilizar nas reações no seu dia a dia essa dessa sua está trabalhando em Geralmente se trabalha com uma concentração de 10 mil colar aqui no canal tem aula sobre isso de como

fazer essa e como é como chegar nesse nessa dessa condição aqui né preparar uma solução trabalho a solução de só tem tudo aqui no canal vou deixar o link aqui em cima para vocês vocês assistam aula e se você quiser saber como proceder com seus primos depois que ele chega chegou comprou chegou no laboratório O que que você tem que fazer com ele aí você vai saber como chegar nessas condições mas geralmente a solução de trabalho está a 10 micromola e aí lá no protocolo e o protocolo ele pede que a gente trabalha uma concentração

final hora que você coloca oprime os reagentes a água o DNA tudo tá ali misturado a concentração final dos Pais na reação vai ser de 04 micromola 04 me cumula ou 400 no lá tanto faz um o que você tem que fazer que quanto que você tem que pegar desse seus 10 micromolar aqui e você tem que apertar lá na reação para que no final você tem isso seus pais a 04 micromola que a concentração que o protocolo Pede então vamos lá a continham as continhas mais utilizados em laboratórios as cores mais utilizadas e um

igual perdão ser um vezes ver um a concentração Inicial vezes o volume Inicial é igual ao C2 vezes o V2 concentração final vezes o volume final a concentração Inicial é a concentração que nós temos aqui nossos nosso plano está Originalmente lá na nossa solução de trabalho há dez micromolar o volume Inicial é quando a gente vai pegar quanto que eu quero pegar desses meus primos vezes o volume inicial a concentração final é o 04 micromolar que é o conta o protocolo pede Qual que é o volume final é o volume da nossa reação a gente

viu lá no protocolo vai trabalhar com volume de ração de 50 anos há 50 micrômetros 50 micro litros Então é só resolver a equação volume Inicial igual a 0,4 x 50 / 10 assim tá fazendo isso aqui no final vai dar um volume de 2 micro e resolver isso aqui né 04 x 5 / 10 da dois nós temos que pipetar nós temos que pegar lá do nosso primeiro na solução de trabalho que tá 10 microondulado 2 micro litros e misturar esses dois micro litros e cada um dos primes do crime dois vetores o plano

é forte 2,3 o pai me reverse colocá-la na reação para que no final nós tenhamos uma solução de 50 micrômetros um caos primas estão a 04 micromola de concentração final Então esse foi o primeiro passo determinar a quantidade de prima que ele vai apertar tem um para cada reação para cada primer dois micro-ônibus a quando a gente vai que tá beleza determinamos a quantidade de pragas vamos ver terminar o DNA o seu DNA mostra que você vai colocar ali certo lá no protocolo ele pede acho que é de 02 a 200 no gramas de Daniel

CD né que você utilizar aqui o nosso e vai trabalhar em mais ou menos comentar vão trabalhar com sem nó gramas de DNA essa quantidade Então passa o número dois das nossas continha saque é a quantidade quantidade quantidade de o DNA ou você ganhar tá pegando que você tiver trabalhando aí certo então aqui ó pode uma mostra nosso determinamos que vamos utilizar Selena o gramas como eu deixei no segundo gramsci chutei você aí no seu laboratório vai ter que testar alguma concentração uma quantidade dentro da faixa aqui o protocolo pede eu fui ali mais ou

menos no meio do caminho seguir gramas você que costuma funcionar muito bem você pode trabalhar com uma sabe essa concentra essa quantidade Se você quiser a nossa mostra mostra a gente traiu por isso ficou à mostra que a gente está trabalhando aqui eu sei que ela está numa concentração e só que vai variar lá para você né Cada a nossa vai dar uma concentração a nossa mostra aqui as duas aí vai tomar com 12 nossas as a nossa mostra está com 10 nem 11 gramas de DNA por micro litros Isso significa que a cada um

microlite nós temos 21 Gramas então nós temos 20 na grama de DNA a cada um microlitro de amostra e nós queremos pegar sem programas tô indo em um micro gente entende 20 nós precisamos no nosso protocolo sem nova gramas quanto que a gente tem que pegar em microlitros da nossa amostra para pegar a quantidade certa tá diferente do da continha anterior que tava trabalhando com concentração aquelas campanha trabalhou com quantidade o protocolo lá nos primeiros pedir a concentração final do prima narração gente usou ser um ver o negócio é 2002 aqui não um protocolo tá

pedindo a quantidade final de DNA lá na reação não é a concentração também está trabalhando uma com uma regra de três Então se em um micro litros nós temos 20 no nó gramas quantos micro gente tem que pegar para conseguir pegar tem que pegar que vai pegar os 100 gramas Então é só uma continha as uma regra de três aqui faz a inversão né Então vai fazer sem nanograma às vezes 1 / 20 essa condene tá fazendo né Corta aqui corta aqui nós 15 micro litros de amostra de DNA ou se DNA para no final

ter o sendo adolescente precisa gente pipetar cinco micronics da nossa mostra que está 20 monogramas por microlitro gente pegar e pesar tirar de lá em Cinco micro litros e nós estamos tirando automaticamente sem nenhuma gramas certo é isso que está fazendo então é estabelecemos descobrimos quanto que não tem que apertar para terceiro ano gramas de ler Vamos para o terceiro passo agora beleza vamos para o nosso terceiro passo que é preparar uma vez que é o seguinte Olha o racional que não há vamos seguir vou copiar o que tá escrito que pede o protocolo protocolo

aberto seguinte quando a gente vai colocar de Jump Start e Jump Start contém todos os quase todos os ingredientes hapcl tem enzima tem um tampão tendendo interpretem cloreto de magnésio em tudo que a gente precisa ali que é que falta primer específico do meu suprimentos suprimentos e o DNA específico Meus Primeiros experimentos certo só ele tem tudo menos amostra e oprime o protocolo sem que fosse fazer uma única reação de PCR o protocolo tava pedindo para gente 25 micro litros de anti estático mas nós temos que colocar o Primer forte que a gente já sabe

quanto vai colocado primeiro forte e nós temos que colocar também o Primer reversa certo cada um dos primos gente chegou a gente fez as contas lá na primeira parte né da dos pontinhos ele terminou que tinha que colocar duas e micro litros de cada um dos primers para gente ter ele na concentração adequada que era 0404 micromolar beleza nós temos colocar também a mostra nem eu tô cadeirinha aqui tá bom o seu DNA o seu DNA almoço aí já terminou aqui a alcinha nanograma a gente tem ler para ter 100 gramas a reação teria que

interpretar era assim com micro litros do do DNA da nossa mostra certo cinco microlitros da amostra nós temos também que colocar água para completar essa relação aqui de tal maneira que no final nós tenhamos 50 microlite ração protocolo para 50 litros de reação toda a gente vai fazer É somar esse 25 mais dois 27 + 2 + 5 - 50ul gente só mais só aqui fizer menos 50 a gente vai ter o volume de água a gente precisa que dá 16 micrômetros tô soma agora 25 + 2 + 2 + 5 + 16 das 50

aí tá pronta a nossa reação cada reação de PCR Nossa vai ter é se esses volumes aqui de ingredientes 25 mil coisas juntos touch 2 o primo forte dois reversa cinco DNA e 16 de água beleza tá prontinha só que acontece tem uma mãe aqui uma um truquezinho O que é muito interessante para quando você vai fazer várias versões de pensar em vai trabalhar com uma dificilmente vai fazer nenhum outros a fazer um monte aqui nosso que a gente vai fazer só duas não vai fazer três com utilizando o contando com negativo duas amostras mas

o negativas e aí o lance é o seguinte ó vê esses ingredientes todos aqui desse ingredientes o que que é cubum o que que é comum a todas as reações seja da mostra um da nossa dois O negativo que como outras reações O Diabo Está comum todos reações não teríamos tarde todas as minhas reações já que tá trabalhando com esse mesmo alvo vamo trocar meu forte outro reversa todas as reações não tem água o que vai variar de uma para outra mostra uma amostra uma reação vai estar Moção autor de amostradores automáticos negativos até água

no lugar da mostra certo então nós vamos fazer é esses esses componentes aqui esses quatro componentes eles são comuns a todos os Elas têm o que que eu posso fazer em vez eu pipetar individualmente na 25 de jumpstart uma amostra 25 do dia constante na outra mostra o estágio no negativo eu posso misturar 25 25 25 de outros Tati 75 micro litros dele que acomoda as reações em misturados no YouTube para não ter que ficar apertando individualmente lá depois faça a mesma coisa comprar mais forte pra me reveste faça um mix eu faço um vídeo

eu misturo sério são comuns pronto pétales individualmente então a gente vai fazer isso preparar esse Mix nós vamos fazer três reações entender aqui nós vamos fazer três reações não faz três reações eu tenho que juntar 25 micro litros de outros ativo esses três vamos fazer aqui 75/2000 coisa de casa paga vez 3 a 6 horas aqui do outro Prime 6 o DNA não entra nessa conta porque ele é individual ele vai ser proprietário de um individualmente lá na plaquinha certo ele não entra essa conta aqui não entra na conta você pode colocar nessa conta só

para facilitar na matemática mas ele não vai entrar no mix né ele não vai entrar no mix E aí 48 micro litros de água aqui dá aos 16 aqui X3 e no final nós temos aqui acho que eu nem vou fazer essa conta para não complicar que tá o que a gente tem que montar na frente força é só para a gente quisesse aqui só para fazer a a comprovação que as contas estão certinhas Você poderia você poderia multiplicar essa aqui por três não vai para enfeitar esse lá na reação só para você verificar suas

contas são certas né Vai Multiplicar isso aqui por três Você vai dar o 15 que eu vou até colocar ele aqui ó só para você fazer as continhas e o 50ml também por três se vai dar os 150 é que são três vezes né só para você fazer as contas o que é comum a sua pessoa que vai fazer parte do mix é isso daqui ó a água os primers e o dia que está que eu coloquei esse 15 aqui o 150 só pra gente fazer a conta o que se você fizer 150 ou melhor

se você quiser 75 + 6 + 6 + 15 + 48 dá 150 Só para confirmar que as contas são certinho certo então tudo bem que é muito simples em vez o proprietário individualmente cada um desses ingredientes se sintam juntos 33 volumes na reação da desse componente da reação um tubo 3 volumes essa aqui muito três essa aqui que é comum a todos eles depois o perto é um volume XL que eu vou fazer as coisas que a pouco complicado Volume X ali na reação para pronta e ficar fazendo vários metais ao mesmo tempo time

desnecessários Só que ainda tem um lance que tem um lance aqui nós vamos fazer exatamente três reações nós vamos fazer a moça moça 26 Tipo se você fizer esse processo aqui e começar a distribuir o mix nesses três porquinhos existe a possibilidade hora que você for petar o último Pocinho falta um pouquinho do mix porque tem um errinho de bebê taxa cada vez que você perto não tem um erro normal ele tem um erro se você fizer a continha aqui exatamente em cima do volume que você precisa a gente vai para três reações você fez

exatamente em cima de três reações é provável que hora que você chegar lá na último último Pocinho aí você tiver completando um mix lá no postinho do negativo falso um pouquinho forte alguns micro litros é aquela reação vai ficar completo e sempre quando você fizer um mix como é isso é interessante você adicionar uma porcentagem a mais de já gente aqui de ingrediente para você compensar esse ano de pedágio na vida real você pode eu recomendo que você é com coloque mim os dois por cento a mais do volume total de raça pode colocar aqui

ó fazer as continhas para 3.3 reações 3.4 reações que pode fazer isso aqui no nosso caso como a gente tá a gente rico eu sou o ingrediente sobrando eu vou fazer vezes quarto só para mim ficar com os volumes picadinhos ali eu volto você poder fazer vezes com a se você quisesse também e aí você vai ter um volume pouco maior aqui que vai facilitar vai evitar que você fique forte em a gente lá na proprietário talvez quatro aqui ficaria sem 88 de cada Prime é o DNA né é a Só para confirmar suas continhas

estão certos aqui tá certo 20 Tá certo e 64 de água eu tô aqui no final a gente tem os volumes aqui de 200 no micro-ondas só para fazer a contam no nosso mente nós teremos esses ingredientes aqui o DNA não que a água em que também Beleza então agora vamos fazer isso lá na bancada na prática vamos fazer isso na prática vai ver eu vou preparar esse Mix depois distribuiu o mixer amostra lá na plaquinha E aí a gente não para quem não vamos aturar só três Subimos vamos usar tudo e depois a gente

coloca a reação para correr vamos maravilha vamos colocar a mão na massa agora eu vou dar umas dicas aqui para gente começar primeira coisa que vai fazer um Mix É não pegar o mix entrar um mix da Mac odiamos Tati e a partir dele preparar o nosso massa M que você colocando o primeiro a gente fez ali na lojinha sobra já vou logo de cara dar uma dica aqui para vocês que que eu gosto de fazer nesse aqui nesse caso aqui só especialmente importante eu gosto de pipetar os volumes maiores por último Então eu vou

apertar primeiro o Primer depois o DNA e por último eu coloco Oi Tati Mix porque quando eu coloco o mixer um volume maior eu aproveito esse volume Grande para fazer uma organização ali da na minha reação a hora que eu tiver colocando ela daí do tubo certo é isso que eu recomendo que você faça no eu falei que no caso do destaque só isso é mais importante porque o Diabo Está Aquele colorido ele tem um acordo ele avermelhado por quê que dessa cor além de só que ser útil lá na eletroforese que a gente vai

ver na próxima aula na aula da semana que vem que vai fazer eletroforese dessa reação ele também a útil porque você consegue ele tem uma coloração você consegue saber se você já fez os ingredientes ou não ali no seu tubinho o nosso a placa a gente vai fazer só três né então é difícil de errar mas se você tiver perguntando uma placa de sei lá 96 polos 384 portas faz um dos três horas você tá na mente se perde você tem um ingrediente que é colorido te ajuda a saber se não consegue saber e se

você aproveitou ele ou não não tenho Deixa ele por último por isso também nesse caso Então vamos começar o prefeito para assumir que sou tua o lado nós vamos colocar sem micro isso juntos tarde depois a gente coloca ele vão colocar ele por último cada primer nós vamos colocar oito micro litros certo oito micrômetros meus pais já estão aqui é naquela concentração de 10 micromola que eu falei para vocês quando vocês forem Trabalhar onde vocês podem fazer ração de você se você não tirar o Primer ele vai estar congelado aí você não colocar lá no

freezer o que você tirado fiz menos 20 ele vai estar congelado que você vai fazer isso vai deixar ele descongelando pode deixar fora do gelo mesmo não tem problema o prima sozinho tem problema ficar fora do Gelo deixa ele fora do Gelo descongelando a mesma coisa serve para o dia que está tio para o máximo que você tiver utilizando a mesma coisa serve para moça você nunca peta uma mostra uma solução qualquer antes dela descongelar completamente tá bom não se esqueça disso porque no processo de congelamento de uma amostra processo de congelamento de uma solução

aquela parte que congela Primeiro ela fica menos concentrada os ingredientes e os componentes da solução e são expulsos da da parte da parte congelada da mostra então a parte que tá não está congelada a parte que está congelada ela tá mais diluída a parte que está não congelada em solução ela está mais concentrada isso no congelamento no congelamento acontece a mesma coisa que você descongelar mostra a concentração da sua solução que já está das congelada não é a concentração deveria na concentração final porque a concentração de congelado e descongelado diferente Beleza então sempre espera descongelar

por completo descongelou que você vai fazer vai fazer homogenização você pode homogenizar é que pipetando o dedo a bater o dedo aqui mesmo você pode utilizar um bota que se você tiver aí no seu laboratório não tem problema tá evita foi detectar e a amostra de DNA genômico por muito tempo que ele pode degradar evita vortexar a soluções contendo enzimas pode vou ter que usar pode mas de leve não faz forte não se você tiver por cidade de fazer uma organização na mão melhor aqui você pode poderia fazer assim poderia fazer um vídeo tiver o

Spin Não esquece da o Spin aquela centrífuga é rápida pode dar um espinho para trazer Depois de homogenizar toda a solução para o fundo do tubo no Canadá na parede do Canadá na tampa e você não corre risco de perder até a gente não contaminar a gente tá bom então faça isso desse congelei homogenization garantir que não tem nada na parede não tem nada na tampa que eu não vou perder nada de abrir Vamos começar com o pé taxa Então vamos lá nós vamos conversar com oito micro litros de cada primer né Eu não eu

não arrumei meus primos aqui ainda se organizar minhas coisas aqui para não fazer bobeira eu tenho sistema de organização é uma dica essa coisa minha você pode fazer o nosso você quiser eu gosto deixar meus meus ingredientes não se a gente separados a gente tal maneira que eu sei que ele já foi utilizado o seu tio fala ainda que é muito fácil Se perder Já coloquei o prêmio foge pô se você já coloquei ele se eu coloquei você não colocou ainda não saber você colocou não tem pode ter olhado e no volume passa mas você

pode ser perder então eu tenho organização que eu gosto de manter aqui para saber o que eu já usei eu já viu que eu não usei ainda Beleza vamos começar a fazendo aqui Eu vou conversar com o primo vamos colocando os primes essa aqui não pega está fora de óleo aqui Oi vamos conversar com oito micro litros então de cada um dos primes Eu também gosto de interpretar de novo é uma organização minha você não precisa fazer isso mas eu sempre gosto de colocar o primeiro Ford sempre ele antes do reverso sempre e no reverso

porque se eu me perder eu tenho essa informação Extra ali para me ajudar me achar então estou ajustando aqui para oito micro litros 18 micro litros foi oito micro litros do plano é forte o forte tá aqui a uma coisa importante que eu estou trabalhando com você a gente aqui em temperatura ambiente por que que eu estou trabalhando com os reagentes temperatura ambiente porque esse kit esse mastermind anti estático e permite fazer isso se você tiver trabalhando com o kit o Master mix aí que não tenha um sistema rosstat uma tática algum sistema Hot start

de bloqueio dela você não pode trabalhar a temperatura ambiente tem temperatura ambiente a solução eu gente viu na uma prática né a reação a vai acontecer mesmo em baixas temperaturas vai gerar um monte de fragmentos inespecífico juntos tá gente tem tem arroz Tati então eu não preciso ter um sistema de tarde eu não preciso trabalhar no gelo se eu não quiser tá não tem amostra Ângelo por Por garantia Então vamos parar de falar sou se preparando Mix primeiro há 8 mil litros do painel forte tirei ele não usa mais não vou usar mais porque ele

vai para o mix eu tenho aqui o meu tubinho de Mix ele tá vazio vou preparar a reação aqui em cima então 8 minutos do forte dentro do Binho e o Ford Eu não vou usar mais vou deixar ele guardado lá separei no YouTube aqui na minha organização para não perder vamos fazer a mesma coisa aqui para o reverse ou oito micro-ônibus do Reverse se isola que o tubo para me perder mais há 8 mil inscritos no reverso Maravilha Qual que é o próximo ingrediente colocamos primas Vamos colocar agora a água então sem 64 mil

litros de água isso aqui não entrega em 64 micro-ondas de água o segundo maior volume 64 de água e em água tá aqui eu vou jogar lá porque eu não vou usar mas também na verdade eu vou usar assim para fazer O negativo né Fazer o negativo vou precisar dela ainda misturei aqui com os primos estão meu amigo Você tem água e já tem praia agora a gente vai colocar agora a gente pode colocar o de outros tática é o maior volume são sem micro litros vou juntar aqui para 100 micro litros o centro de

Fabrizio gianfratti antes porque ele tem essa tampa aqui para o das duas mãos para abrir E aí e sem microliter é colorido fácil me ver a hora de pipetar vai ficar mais fácil também colocar aqui com cuidado que está rack Zinho aqui para ele cair tem uma beleza e aí eu aproveito o maior volume para fazer uma organização Aí fica fácil de ver uma organizei e faça homogenização aqui de cima o pedal né passinho para baixo aqui com o dedo na pipeta volta de 25 e 50 vezes vai estar muito bem homogêneo Osasco fechou você

pode dar um voto do protocolo permite que você deu uma volta aqui se você quiser mas dá uma volta não dá uma volta aqui por muito tempo não tá porque você tá trabalhando com em cima essa é uma enzima protegida com anticorpo então é legal você dá um volta aqui nós de leve Fechou então aqui então Mix Pronto agora nós vamos distribuir os pacientes então nós preparamos o nosso Mix nosso mastermix vamos distribuir isso agora nos passinhos o que que falta ali Nossa reação falta template falta o DNA ou você vem aqui as casas linear

falso DNA certo então vamos colocar primeiro o DNA da amostra um no YouTube um o DNA da amostra do You Tube com dois e no negativo a gente colocar água né para verificar se o agente não tem contaminante relevo vamos aqui alto bem um e esse pequenininho agora que é o que cabe lá no nosso termociclador você tem que saber aí se o seu com que tipo de tubo ou placa só temos secador é compatível aqui no nosso caso eu sei que iria compatível com esse tubinhos pequenininhos aqui 02 ml tá bom aí você tem

que verificar isso antes a gente fazer a sua reação de novo raça o mesmo Nacional Vamos colocar primeiro a mostra que o volume menor depois a gente coloca o mix só a mostra as suas colocar 5 micro litros né pra cá da reação é 15 micro litros de DNA Então tá aqui a mostra um a amostra um peguei já não vou usar mais deixa ela aqui no cantinho e aqui cuidado com esse tubinho que ele é bem delicado se você apertar aí estoura tô cuidado na hora de fechar ele de abrir um tubinho muito delicado

ele história e mais agora eu pegar cinco microlitros da amostra 21 nós vamos colocar no tubo 2 e agora vamos pegar cinco mil litros de água para fazer O negativo e cadê a nossa eu tinha colocado aqui no cantinho 15 micro litros de água para fazer o negativo não pode amplificar é feito isso agora a distribuir o nosso mastermix e já colocou os cinco micro litros de água agora vou colocar 45 Microlins no master Mix certo a gente preparou 45 de uma supermix já está aqui preparado nosso mim que está aqui se você deixou ele

descansando muito tempo na bancada homogenize de novo Nosso gente homogêneos ou agora e vamos lá 45 eu ponho tubinho aproveita o volume maior para homogenizar homogeniza bem o Kendall 45 50 vezes aí tá bom 25 a 50 vezes tá bom é se você colocar essa solução na parede dá um spin naquela centrifugada rápida para tirar da parede uma outra coisa interessante também é que se você quiser bolha fiz você vai se fizer A Espuma é um duas problemas aqui se você fizer espuma na hora de fazer uma organização rap Preto ali um pouquinho mal né

pega na superfície da solução e investe na solução lá faz espuma aí é legal você dá uma centrifugada nessa sua solução Zinho aqui na sua reação da um espinho põe-nas entre fica por alguns Alguns segundinhos para tirar a desfazer-se espuma se você fizer bolha bolha na parede do tubo aqui na solução aqui tá mostrando tá vendo aqui nesse tubo nessa narração tem uma olhadinha lá tá bem na superfície ela também nosso Que tipo de bolo aqui não há problema prova mente ela vai estourar lá nos primeiros ciclos da PCR e não vai interferir Agora se

a sabor ela tivesse na parede aqui embaixo ou lá no fundo aí você bota um problema pode atrapalhar um pouco a reação Mas aqui é tranquilo pessoalmente uma pessoa que conversa ou não então a mostra um tá aqui beleza vamos fazer a mesma coisa para nossa dois né 45 e homogeniza Olá pessoal pedal beleza E aí e agora vamos parar O negativo O Que Sobrou um pouco aqui porque a gente fez uma reação a mais né sobrou aqui tem hora que a gente tem uma reação a mais aqui dentro né certo então eu sobrando e

vai jogar fora certo quando você for fazer aí não deixar sobrar tanto assim que nem a gente né que ele fez por que tá correndo sobrando Vamos fazer uma demonstração a riqueza absoluta na vida real não é assim a gente vai evitar e a gente vai evitar essa que ela ficou com bastante espuma aconteceu que eu falei mostrar para vocês E você tá bom para gente demonstrar centrifugação então isso aqui ficou sem espuma vamos dar uma espinha essa aproveitar que ficou ruim vamos lá Spin nessas amostras tudo para trazer tudo profundo e dando espinho gente

vai ficar me secador programa reação me manda bala nessa pessoa aí beleza vamos vamos dar uma espinha rápido só para ver se tira essas por mim essas bolhas na superfície da hora tá assim vamos ver se dando experiente resolve esse problema aqui vamos lá é só um é só um pulsos explicou se fala só dá uma uma giradinha rápido aqui a beleza vamos lá sabe aquele que aprendendo que maravilha e resolveu tiramos as bolhas Podemos seguir para PC agora vamos lá no time secador tudo pronto vamos colocar essa corrida para funcionar vamos fazer essa PCR

agora ó eu já deixei a corrida aqui preparada Eu não eu montei o mesmo aqui já programei o equipamento por quê Porque Claro estamos falando você de um jeito adianta mostrar para vocês como é que funciona isso aqui aí no seu laboratório vai ser outro então todos eles são mais ou menos mesmo jeitão só tem essas diferenças né Eu já montei aqui então tá do jeito que a gente precisa vamos lá temperatura da tampa aquecida a 100 graus celsius sempre a senhora temperatura máxima da PCR Ou seja a gente vai evitar evaporação de evitar condensação

dos reagentes na parede na tampa no tu vai acontecer um pouco mas a gente dá uma boa evitado a gente evita colocar o que olha o mineral é original tô de férias espero que você não tem que usar óleo mineral no laboratório se precisar tudo bem aí se você puder trabalhar com o Paulinho que tem tempo Aparecida melhor não vai evaporar volume 50 micro litros fechou eu quero passo 94 dois minutos temperatura para ativar DNA polimerase bastante em seguida entramos na PCR 9455 7235 vezes por último a gente vai para a extensão no final 72

graus Celsius por cinco minutos e quatro graus Celsius indefinidamente aí ficar temperatura de geladeira se quiser deixar correndo durante a noite overnight pegar um dia seguinte pode é isso aí mais uma informação é por esse equipamento aqui nós vamos colocar trabalhar com tubinho lá para falar com placa em tudo gente vai trabalhar com tudo nesse caso porque a gente vai trabalhar com tubo tem que deslizar o suporte que a gente coloca dentro do do equipamento ali em cima do Bloco do equipamento cima do tá no secador propriamente dito porque se você dependendo da que também

você que vem no seu caso se você precisa do adaptador ou não porque muitas vezes não fechar a tampa você tá com turbo e não tem um adaptador você esmaga tudo aí evapora ele tá bom então colocamos aqui o adaptador já parece que eu tô sentindo a tampa aquecendo-a e não foi a mão que vai estar quente para caramba né a mostra um que no caso não tem exatamente um local para colocar eu gosto alto trabalhando com pouca mostra eu prefiro sem trabalhar no centro do bloco no centro não temos secador se eu puder trabalhar

no centro eu deixo no centro amostra luz é o negativo já colocou Já fechou aqui não tem muito segredo fecha equipamento e bota para correr daqui algumas horas a gente volta com essa corrida aqui pronto para saber se ela funcionam [Aplausos] Maravilha Terminamos uma reação de PCR Vamos ver que se ela funcionou E aí só não sei não dá para saber tem que fazer eletroforese agora até a próxima aula estou na próxima aula vamos ocorrências a moça que na eletroforese para ver se ela funcionou aproveitando aqui pra gente finalizar esse vídeo gostaria de agradecer mais

uma vez a médico disponibilizar todo esse espaço aqui para gente ela parece ela conta que dá por ela conta que tá os seus parceiros e colocar os parceiros à nossa disposição os reagentes aqui o laboratório que nós estamos no SENAI biotecnologia em São Paulo Então tudo muito bom muito Fantástico Eu gostaria de falar que eu adorei utilizar esse esse máximo isso aqui muito bom mastermix funcionou muito bem fácil visualizar a fácil de trabalhar excelente aí Cês viram as condições não tem muitos o cara mama uma rosa se você tiver posto deve trabalhar com a celulite

principalmente com a menos que um dia pra ti eu faça porque vale a pena bom demais lembrando eu falei no outro vídeo eu quero falar nesse também se você tiver interesse em trocar uma cena que segue seu laboratório se você tiver começando experimento que quer testar uma semente você pode pedir para mim é que dá uma nossa para vocês olha de habitat aqui eu tenho uma moto de outros Tati me manda uma mostra onde encostar defendeu laboratório que eu quero testar eu vou comprar essa quero ver se ele funciona bem é um ano e meio

para mete que eles vão avaliar seu caso e em sim fizer sentido eles vão Enviar o almoço para você se pode testar gratuitamente eu vou deixar e meio da América embaixo você se você quiser manda mensagem para ele se manda e-mail para ele fala do seu caso conta um pouco sobre o que você vai fazer eles vão avaliar esses a sentir dores vamos lá mostra você se precisar também eles vão colocar um especialista de produto à sua disposição para te ajudar padronizar esse negócio de tirar suas dúvidas no laboratório Eu espero que você tenha gostado

eu sou Eduardo caçando essa biologia molecular a gente se vê na próxima aula é só na onde ela tem pressa não [Aplausos] E aí [Música] [Aplausos] [Aplausos] [Música]