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fala pessoal boa noite tudo bem com vocês eu espero que sim sejam bem-vindos aqui a mais uma aula hoje do cromac sobre colunas cromatográficas esse assunto tão pertinente no nosso dia a dia a gente já tá aí numa breve jornada né falando sobre cromatografia líquida sobre colunas cromatográficas também tanto na parte de LC Quanto na parte de CG né para quem já acompanha a gente aqui no canal sabe que nós temos uma relação muito grande com a linha de cromatografia espectrometria de massa de uma maneira geral e aí decidimos recentemente fazer esse projeto né que

chama-se cromatografia a jornada em que eu thgo falo sobre cromatografia líquida e o Bruno Carvalho fala sobre cromatografia gasosa então semanalmente nós estamos aqui no nosso canal falando sobre cromatografia e temos a satisfação de est com vocês na companhia de vocês já estou vendo aqui alguns boa noites aqui né o pessoal que já tá assistindo a gente aqui a Leila o João a Jéssica Boa noite pessoal sejam bem-vindos ao nosso canal a Carmen também seja bem-vindo hoje vai ser uma discussão muito legal sobre cromatografia e especificamente sobre colunas cromatográficas a gente falou na aula passada

na na aula de colunas cromatográficas e suas especificações os detalhes do que é uma coluna cromat falamos sobre base de ligantes falamos sobre partículas cromatográficas E hoje nós vamos partir pro detalhe e a decisão de como selecionar os ligantes na cromatografia líquida os ligantes das colunas cromatográficas então para você que tá chegando agora aqui no nosso canal seja bem-vindo convido vocês a acompanhar a gente aqui seguindo o nosso canal e também Aproveite a oportunidade para curtir esse vídeo aqui digo para você vocês que faz uma diferença muito grande aqui vocês curtirem acompanhar ativar a notificação

incentiva o projeto a continuar acontecendo né a gente como o Bruno fala né não recebe nada por isso né diretamente né A nossa empresa ela é comercializa colunas cromatográficas né comercializa produtos para laboratório mas diretamente a gente não recebe nada então a gente mantém aqui ess fomentando sempre o assunto né de cromatografia porque a gente gosta além de tudo e a gente entende que se você tiver bastante conhecimento em cromatografia líquida em colunas cromatográficas você vai ter sucesso na sua carreira também é uma carreira fascinante né eu comecei lá 14 anos atrás por sorte operei

um hplc modular e comecei a aprender né sobre cromatografia hoje tô aqui podendo falar para vocês e compartilhando um pouquinho mais da experiência que eu tenho já tá nós vamos começar a nossa aula aqui tá a gente vem trocando algumas informaç ações com vocês né e a gente entende que é um esforço também da parte de vocês est aqui acompanhando essas aulas né não é fácil né você chegar do trabalho muitas vezes cansado e ainda assistir um conteúdo que muitas vezes é denso né Muito informação muitas vezes então considerando isso a gente vai tentar sempre

se manter dentro de uma hora uma hora e pouquinho as aulas aqui E para isso eu não vou ficar enrolando não tá Eh vamos direto ao ponto aqui né né boa noite Henry Boa noite thí Boa noite Letícia eu começo a ver uns nomes eh comuns aqui né vocês sempre estão por aqui Parabéns para vocês que sempre estão acreditem vocês estão acrescentando o conhecimento na carreira de vocês e com certeza vocês estão evoluindo né vamos junto nessa jornada aí que tem muitas aulas pela frente e já adianto aqui para vocês Que esse assunto de colunas

cromatográficas pessoal ele tem uma profundidade muito grande e aí nessa profundidade é é muito difícil passar todo o conteúdo em uma hora Du horas como foi né juntando a aula passada mais essa aula então eu bolei aqui mais uma parte sobre colunas cromatográficas mas a aula de hoje pessoal tá muito massa fica comigo até o final que você vai aprender muito porque a gente vai falar sobre colunas e especificamente sobre os ligantes c18 que é a maior parte de uso nas aplicações de cromatografia líquida vocês vão entender as diferenças do c18 e o porquê de

alguma as nomenclaturas na hora de decisão e selecionar e a coluna cromatográfica pro seu método beleza Ivo Boa noite pessoal Elisângela Boa noite também Opa Fabiano um abraço boa noite cara que bom você tá por aqui novamente galera vamos lá eh vou começar aqui mas antes de começar Deixa eu tirar um pouquinho meu microfone aqui de lado que tá aparecendo só Confirme se o meu áudio e o meu vídeo Tá ok eu aguardo aqui para começar a a porque eh só para eu ter certeza se vocês estão escutando bem se tá tudo certo eh pra

gente começar aqui beleza vamos nessa deixa eu aumentar aqui minha minha tela vou ficar pequeninho aqui Eh galera só um recadinho rápido aqui para vocês né todas as aulas a gente tem o propósito de de fato a gente fornecer para vocês Um certificado de participação dessa aula e aí Caso vocês desejem eh receber esse certificado o último link da descrição do vídeo aqui tem uma descrição longa com vários links link do nosso site do tanto do chroma quanto da Matrix tem os links dos nossos cursos aprofundados sobre cromatografia líquida e cromatografia gasosa nós temos também

alguns links dos grupos de WhatsApp e telegram que a gente tem aqui no chrom Class e nós temos o último link para você preencher e se você deseja receber o certificado basta você ficar comigo até o final da aula eu vou falar uma palavra chave você vai colocar essa palavra-chave no formulário e a gente vai te enviar o certificado combinado Essa é a maneira que a gente encontrou aí de constatar que vocês estão participando de fato aqui da nossa aula Maravilha Já me deram um ok aqui IV e a Leila e vamos nessa galera muito

conteúdo aqui vamos que vamos Beleza se você tem um colega de trabalho aí por último agora né um colega de trabalho um colega na universidade que também tem e quer conhecer mais sobre colunas cromatográficas envie esse link para el ele tá ele vai acrescentar aí com certeza um tanto de conhecimento tá Então pessoal vamos lá vou começar aqui né do lado mais à direita Aqui nós temos a visão Geral do nosso curso de cromatografia a jornada aqui tem todas as aulas e a sequência de aulas de cromatografia líquida tá só que entre a aula de

cromatografia líquida um e dois tem uma aula de cromatografia gasosa entre a dois e três tem uma aula de cromatografia gasosa Então hoje aqui já é a aula e seis na verdade desculpa cinco a o Bruno vai dar aula seis que é de cromatografia gasosa e depois eu aula 7 mas a aula de LC é aula 4 Beleza então nós vamos partir recapitulando um pouquinho sobre a outra aula e existe uma divisão né vocês vão ver entre e base de ligantes e ligantes na decisão de seleção de colunas cromatográficas Então vou recapitular um pouquinho aqui

eh sobre a aula passada depois eu vou mostrar para vocês eh um pouquinho sobre uma calculadora de colunas que tem um efeito muito interessante na hora de usar o seu hplc ou então transpor um método para um sistema de ultra performance tá Eh eh vou falar um pouquinho sobre resolução cromatográfica vou falar sobre seletividade que é onde mais impacta a seleção de uma coluna cromatográfica separei um guia prático e simples para você encontrar a coluna de uma maneira correta inclusive enviei para vocês eh já no chat quem tá no nosso canal do telegram aí do

do Whatsapp vocês já receberam esse guia prático meu super interessante fácil de tomar decisão de qual coluna seguir Ou pelo menos um Norte de qual coluna selecionar baseado nas características da sua molécula tá Ah as análise de compostos apolares hoje nós vamos falar só de ligantes de coluna c18 C8 algumas particular idades dele e ao final a gente sempre abre para perguntas e respostas também tá boa noite pessoal boa noite Anderson vamos lá vamos começar aqui nossa aula então queria começar com vocês pessoal compartilhando algumas informações sobre eh o que a gente viu na aula

passada né Nós vimos dentro que dentro da coluna cromatográfica aqui eu tenho um exemplo né de uma Coluninha cromatográfica dentro dela existem partículas e dentro dessas partículas existem ligantes né Então essa foto que vocês estão vendo aqui é uma foto microscópica de uma partícula cromatográfica e tem um pouquinho de fé porque dentro dela essa partícula é toda porosa e dentro dela você encontra ligantes esses ligantes conferem uma certa polaridade eh pro pra nossa partícula né E essa polaridade esse ligante sim vai interagir com o nosso analito eh favorecendo né uma retenção dele e tendo uma

migração diferencial podendo gerar uma separação de fato desse do do seu analito de interesse né então quando a gente pega essa partícula dá pra gente dividir em base de ligantes só a estrutura do poro da da partícula né ou então em ligantes em si na aula passada a gente viu tudo sobre base de ligantes falamos sobre sílica falamos sobre tamanho de partícula falamos sobre abertura de poro como funciona de Fato né a formação até de uma partícula cromatográfica o que ela influencia na decisão de seleção de coluna é muito importante essa etapa de qual o

tamanho da partícula e qual a abertura do poro por exemplo porque influencia diretamente na na sua separação cromatográfica ou até além disso na utilização adequada do seu hplc ou do seu uplc caso você não tenha assistido a aula passada volta lá essa aula tá disponível gratuita no nosso canal tem uma série de aulas lá vocês vão poder assistir Célia Boa noite seja bem-vinda aqui quem chegou agora seja muito bem-vindo hoje nós vamos falar só sobre ligantes E agora começa a ficar mais séria aqui a situação porque nós temos uma infinidade de ligantes com inúmeras particularidades

E aí nós vamos passar ligante por ligante na hora de montar as aulas pessoal eu até fiquei pensando muito tempo em e decidindo F assim cara eu preciso mostrar ligante ligante Porque tem uma uma relação muito próxima com a decisão que você vai tomar no laboratório de seleção de colunas hoje para vocês terem uma ideia nós vamos falar só sobre z18 então notem tem muita informação aqui tá Então nós vamos falar sobre ligantes eh os moléculas e os grupos funcionais né que estão presentes né natureza química diversificada desses ligantes interações que podem ser exploradas neles

especificidade e seletividade eh de cada um desses ligantes tá voltando ainda e segurando um pouquinho na aula passada em resumo ao final da aula a gente chegou a seguinte conclusão para você decidir qual método utilizar aliás qual coluna selecionar você basicamente acaba ficando com quatro pontos extremos de decisão né Então na hora de desenvolver um método ou se você tiver um método pré-estabelecido Você pode ter uma necessidade de variação de PH E para isso nós temos algumas tecnologias híbridas né nós trabalhamos com a BH que é da Waters né uma partícula completamente porosa que aceita

uma variação de PH muito grande né Tem muita versatilidade essa coluna é muito robusta agora caso você queira e Direcionar para uma metodologia que você já tem pré-definida e também manter ela de uma maneira eh controlada com pique Shape uma simetria de pico muito melhor você pode direcionar pra tecnologia csh tem uma estrutura eh um pouco mais estabilizada do que a BH agora se falar assim não thago eu preciso de uma coluna de rotina que eu vou fazer 12.000 injeções e eu quero que ela dure Talvez uma hss vá atender as suas especificações porque é

uma partícula que eh consegue receber uma uma ela tem uma estabilidade mecânica muito grande ela consegue suportar uma pressão muito grande ou então caso você queira muito mais eficiência nós direcionamos sempre para as colunas de eh núcleo sólido nós falamos sobre as particularidades de todas elas na aula passada também tá mas recapitulando aqui para não deixar vago nós falamos também sobre um processo né quando a gente seleciona essas eh colunas e as respectivas partículas nós falamos sobre a decisão baseado no tamanho da partícula no tamanho da coluna e também també na porosidade dessas partículas só

vou dar um galinho na minha água aqui mas o que que eu quero dizer com isso eh existe um um uma relação possível de ser feita de eficiência cromatográfica quando a gente fala de eficiência cromatográfica a gente toca o ponto de que quanto a gente maior tem eh uma eficiência melhor pode ser a nossa separação cromatográfica Só que essa alta eficiência Ela depende diretamente das partículas que a gente tá utilizando e basicamente se a gente tem partículas menores colunas menores e poros menores a gente tem uma alta eficiência cromatográfica tudo isso tá relacionado na equação

de vinter que relaciona a altura do prato teórico e também a difusão das partículas dentro da coluna A difusão longitudinal e a resistência na transferência de massa nós tivemos uma aula passada de cromatografia líquida com o Bruno Carvalho e quem acompanhou a a aula do Bruno e a minha anterior também toda essa explicação da equação de van dinter tá no detalhe mas eu queria que vocês guardassem essas informações porque hoje eu não vou falar mais disso só vou falar de ligantes só que para você tomar decisão pelo determinado ligante você tem que ter tomada decisão

Antes pelo tipo da partícula se é uma partícula de 1.7 micrm se é uma partícula de de 2.5 micrm E qual é o tamanho dessa coluna que você deseja ou ainda Qual é o tipo de partícula que você deseja se é completamente porosa ou se é de núcleo sólido Tá bom a gente viu lá na aula passada também que baseado no tamanho da partícula a gente consegue ter uma maior eficiência e praticamente é a seguinte regra quanto menor o tamanho da partícula mais eficiente é a minha cromatografia aí você vai parar e falar assim tá

beleza thago ótimo hoje eu tenho uma metodologia analítica que eh no laboratório em que eu faço a análise eu tenho colunas cromatográficas de eh 15 cm 4.5 MM de diâmetro 5 micrm de tamanho de partícula agora você tá me dizendo aqui que uma coluna com tamanho de partícula muito menor vai ser eh mais eficiente então eu acredito n que você tá falando aqui thago e e eu quero adquirir uma coluna eh com tamanho de partícula menor com uma tecnologia um pouquinho melhor por onde que eu começo aí entra algumas informações que eu vou passar agora

para vocês tá quando a gente pensa em eh migração né de método transposição de método de eh uma coluna de uma partícula maior para uma menor a gente tem que levar várias coisas em consideração mas a primeira dela é o escalonamento de de uso da sua metodologia então se você tem na sua metodologia uma uma uma determinada fase móvel um determinado fluxo uma determinada temperatura um determinado tempo de análise um determinado volume de injeção saiba que tudo isso precisa ser adequado à Nova coluna então para você adequar tudo isso na sua nova coluna eu trago

para vocês aqui a calculadora de de colunas tá essa calculadora de colunas pessoal é muito interessante é muito legal essa eh calculadora de colunas fiz questão de trazer aqui para vocês porque eh é um Norte é um é um direcionamento para você seguir na hora de transpor o seu método de um hplc para um uplc e aqui eu queria abrir um parêntese para vocês muita atenção nessa hora o thgo tá falando aqui que eu consigo pegar uma coluna de hplc e colocar agora uma coluna de tamanho de partícula de 1.7 micrm e rodar o meu

método além da da migração que eu vou mostrar aqui para vocês como calcula esse esse essa transposição de métod de método existem muitas outr muitas outras considerações a serem seguidas por exemplo Ah quando você eh adiciona né uma coluna de 1.7 micrm vocês vão ver que a pressão no seu sistema cromatográfico ela tende a ser muito mais alta e muitos e equipamentos de hplc eles não suportam aliás todos né não suportam eh pressões aí acima de 6.000 PSI geralmente tá Ah sistemas de ultra performance os up lcs sim são resistentes a uma pressão muito grande

então essa transposição de método também tem que ser acompanhada de um equipamento adequado nós vamos ver todo tudo todos esses detalhes inclusive volume de sistema lá na aula se eu não me engano a aula sete que a gente vai ter eh diferenças de hplc e de uplc E aí eu vou mostrar para vocês algumas diferenças do equipamento o que de fato tem mas hoje como nós estamos falando de coluna só queria deixar claro para vocês vocês têm tomar muito cuidado com qual coluna você vai utilizar em relação ao sistema que você tem atualmente tá se

vocês têm um sistema de HP C talvez não dê talvez não vocês não vão conseguir utilizar uma coluna de 1.7 micrômetros eu vou mostrar cada uma dessas janelinhas aqui para vocês tá eh outra informação muito importante é sobre a fase móvel a fase móvel que é utilizada no hplc dependendo do aditivo do tampão que você tá utilizando ele muitas vezes não é compatível em concentração e até em característica com o sistema de ultra performance E aí você acaba tendo muitos problemas somamos eh eh você precisa saber muito de resolução de problemas porque vai dar problema

nesse caso aí tá dig essas duas coisas vamos fazer aqui na prática Vamos lá fazer uma um testezinho eh sobre esse método aqui pessoal eu tinha separado um artigo Olha só vocês estão vendo minha tela aí né esse aqui é um artigo vou dar o crédito aqui né pro pessoal aqui eh não sei como pronuncia tá esse nome aqui né mas o s um Senor chamado ou senhora chamada valdres né Com sobrenome valdres é um um artigo sobre separação de compostos fenólicos e antioxidantes tá metodologia básica com eh uso de fase móvel de acetonitrile e

água tá num e com ph ajustado para dois eh com ácido ortofosfórico tá aqui e aí o que o que eu o que é interessante pra gente aqui é são as características do da coluna cromatográfica as características do Gradiente utilizado pra gente colocar aqui na nossa calculadora de colunas então separei aqui ó aqui a metodologia né E esse artigo aqui pessoal eu deixei disponível para vocês baixarem no link que Vocês recebem quando vocês preenchem o formulário que tá lá na última linha aqui da descrição do vídeo tá então vocês vão ter acesso a esse artigo

também né um artigo de de um um uma amostra muito complexa né Vocês estão vendo aqui os cromatogramas aqui embaixo né um monte de pico então numa corrida de 60 minutos aqui de uma coluna c18 e um método relativamente simples né água seton nitrila acidificada por muito tempo mas o que importa aqui pra gente é a calculadora de colunas então aqui pessoal nessa calculadora de colunas que que vocês têm aqui de interessante né de muito interessante tá aqui vocês têm a seguinte as seguintes informações né eh Aqui vocês têm do lado esquerdo aqui tudo isso

aqui que tá rodando o meu mouse vocês TM a qual coluna você tá usando no hplc né ou então uma coluna eh x aqui com tamanho de partícula maior tá sempre coloque a tamanho de partícula maior então aqui eu tenho eh uma coluna de diâmetro de 4.6 tá tudo aqui no artigo tá pessoal então foi uma retirei tudo daqui as informações tá uma coluna de 4.6 uma volume 250 C 250 MM desculpa tamanho de partícula eh de 5 micrm eh você tem uma relação ldp e quem assistiu a aula passada lembra né que é a

relação do comprimento pelo tamanho da partícula de 50 1000 aqui tá Ah quando você eh ele pede também pessoal o volume do sistema eu não vou falar sobre o volume do sistema hoje aqui tá essa informação vou falar lá na diferença entre sistemas de hplc e sistema de ultra performance tá bom só que acreditem um sistema de hplc tem por volta de eh 1 ml de de duell time né que seria o volume de saída entre o o injetor e o detector tá considerando a coluna cromatográfica beleza Eh depois eu vou falar no detalh como

vocês fazem para identificar isso tá em algum momento vocês fiquem comigo aqui nas próximas as aulas tá Ah aqui volume de injeção 20 micol temperatura da coluna 40º e ah tempo de corrida de 60 minutos tá aqui tá todo o gradiente que tava sendo recomendado tá então aqui você tem o tempo fluxo de 0,5 ml 5% de aceta nitrila começa 95% de água Beleza eh São só esses dois solventes sendo misturado uma metodologia de Gradiente por 60 minutos aí eu pedi para ele calcular pra gente uma uma selecionando uma coluna de 2.1 de mm de

diâmetro 50 mm de comprimento ou seja de 10 cm eu tinha colocado aqui uma partícula de 2.5 MM de diâmetro e aí ele deu para mim uma relação ldp de 40 para eu deixar isso um pouco mais próximo do do 50.000 aqui de ldp 50 de ldp aqui que a gente tem eh eu se eu colocasse uma coluna de 1.7 micrômetros E aí dá pra gente começar a brincar com qual coluna A gente e e tamanho de partícula a gente poderia utilizar Olha só as informações aqui embaixo isso aqui já começa a ser um resultado

tá só vou colocar aqui um um Dell time de um sistema de ultra performance nesse caso que gira em torno de 03 300 microl tá Vou colocar aqui 300 micol tá é possível a gente medir existem alguns oplc pessoal que giram em torno de 01 ml eh 01 ml de Dual time tá é possível isso então Eh isso aqui ele pode ser medido na prática tá então tô colocando números subjetivos aqui por enquanto tá só que isso impacta pra gente eh em algumas informações de escalonamento como volume de injeção tempo de corrida né Eh volume

de pré-inca ser eh colocado para estabilização também aqui a pressão possível do equipamento e aqui baseado no no tamanho da partícula ele já escalou num determinado fluxo pra gente ou então tem como você customizar o fluxo aqui eu quero uma metodologia 02 ml por minuto daí estão vendo aqui embaixo pessoal olha só que vai mudando as informações aqui então se eu colocar por exemplo para 03 ó mudou aqui embaixo um fluxo mais maior né de 03 ml por minuto em relação a 02 Você tem uma pressão no sistema maior então ele te dá já a

possível pressão ISO que não é exato tá pessoal é uma suposição né eso que é matemática que é feito né estatística só que o que eu queria chamar atenção aqui para vocês é a seguinte informação olha só que interessante ISO daqui uma coluna uma calculadora de colunas que é para uma sistema de hplc se você quiser manter dentro de um sistema de hplc você tem que ter no mínimo ali uma uma coluna cromatográfica de tamanho de partícula de 2.5 micrm e mas mesmo assim cara olha só 2.5 micrômetros olha o que ele dá pra gente

né a relação ldp diminuiu um pouco e significa que eu posso perder eh em resolução no final das contas porque eu tô perdendo ali pratos teóricos né Eh eu tenho menos pratos teóricos aqui do que aqui isso pode eu posso perder né Eh na resolução aqui na separação cromatográfica e e para eu manter a mesma coisa eu poderia por exemplo aumentar aqui minha o tamanho da minha coluna o comprimento da minha coluna também tá ou seja dá para você fazer testes para você ter certeza de como ele vai funcionar né então vou vou fazer essa

sugestão aqui inclusive Então olha só pra gente manter dentro de hplc tendo uma relação ldp ainda maior ele escalonando pra gente aqui num fluxo de 0,2 ml por minuto aqui eu tava em 1 ml por minuto tá eu poderia aumentar inclusive mas aqui eu tinha 60 minutos na na metodologia de hplc aqui eu tenho 18 minutos a mesma corrida oferecendo a mesma resolução Ou até melhor do que aquela separação que a gente estava vendo aqui nesses cromatogramas tá eh muito interessante isso aqui pessoal é um Norte que vocês podem tomar eh como decisão de seleção

de colunas cromatográficas e mais do que isso um pontapé inicial de método que você pode utilizar porque você pode encontrar métodos compendia com informações direcionadas para colunas de hplc daí para você transpor esse método para colunas um pouco menores você tem que seguir Eh você precisa seguir algumas diretrizes né tá tendo uma modernização do capítulo 621 da USP em que ele tem algumas recomendações também cuidado com isso você não pode passar ultrapassar alguns limites preconizados que está lá então caso você queira seguir precise seguir o método compendial recomendo que você tome alguns cuidados agora caso

você esteja dentro de uma universidade você visualizou um artigo em que você tem e uma metodologia de hplc e você quer colocar em uma metodologia de ultra performance ou então você quer manter no sistema de hplc Mas você quer uma corrida mais rápida mais eficiente mantendo a mesma resolução vale a pena você utilizar essa coluna eh essa calculadora de colunas aí você vai falar thgo e aí como é que eu faço para baixar isso aqui beleza mostrado isso aqui para vocês é deixa eu voltar aqui pra minha minha aula né mas Ah cara muito legal

essa essa calculadora de colunas e além disso muito boa útil para você fazer o seu dia a dia tá eh se se vocês quiserem baixar essa essa coluna vou mostrar aqui para vocês ó basta você colum calculator ó eu tinha digitado aqui já ó esse primeiro link aqui tá é uma calculadora de Colunas da Wats E aí você clica aqui vai lá no último link ó esse executável que tem aqui tá você vai baixar esse executável aceitar algumas permissões E aí você já vai ter acesso ele fica instalado na sua área de trabalho né um

atalho Zinho E aí você já vai ter acesso a essa coluna de essa calculadora de colunas Beleza espero você espero eh ter ajudado vocês aí nesse Nesse quesito também beleza Opa mais gente chegando aqui a Boa noite seja bem-vinda aqui à nossa aula também pessoal tudo certo até então comenta aqui quem já tinha visto essa calculadora de colunas por gentileza e quem já usou se já foi útil se não não for eh se se atendeu né a expectativa de vocês eh Se tiverem alguma pergunta também fiquem à vontade tá como tem bastante conteúdo aqui não

vou lerdear tá mas comentem por favor eh se essa quem já utilizou ou eh quem achou aí interessante né Essa essa ferramenta aí que ela é muito legal realmente tá pessoal a gente vem falando né de inúmeras ferramentas aqui sobre colunas cromatográficas sobre tamanho de partícula e tudo mais mas tudo tem uma relação com a resolução né de que vem a ser na prática uma separação cromatográfica adequada né tem algumas vocês viram aquele cromatograma ali do artigo cromat prama com inúmeros Picos alguns deles eh dava para notar que não tinha né resolução inclusive né E

como a gente poderia melhorar isso a gente vai ver baseado na seleção de ligantes mas o que é de fato resolução na prática né então existe uma definição né de resolução eh sendo a resolução quando você pega um pico em relação a outro né Não vou nem entrar aqui no mérito do que é o cromatograma o que é o pico cromatográfico porque a gente já vem falando sobre isso inúmeras vezes aqui nas últimas aulas voltem lá e assistem Caso vocês tenham alguma dúvida tá sobre isso né mas basicamente você leva em consideração os tempos de

retenção de cada pico e a a a a soma né das das larguras do pico quando a tangente toca equivalente 50% da altura do pico então é medido né a meia altura desse pico aqui uma relação entre um pico e outro e esse número esse valor absoluto ele tem que dar aí acima de 1.5 tá caso não tenha essa resolução a gente tem algum problema né a gente tem uma separação ineficiente só que a separação cromatográfica na prática Ela depende de alguns fatores né e a gente viu também lá na aula do Bruno especificamente né

que a resolução a separação cromatográfica eh ela tem uma relação muito íntima com eficiência seletividade e retenção tá dos dos compostos né eu fiz questão de colocar isso aqui apesar de ser eh bem eh já bem determinado né já bem estruturado porque hoje nós vamos falar de seletividade exclusivamente e vou mostrar para vocês o que a seletividade influencia na resolução cromatográfica então se você não tá tendo né você não tá conseguindo separar adequadamente o seu analito né de interesse pode ter pode haver uma relação muito próxima com a seletividade vou mostrar o porquê da seletividade

quais desses fatores influenciam de Fato né na na separação cromatográfica na próxima aula a gente vai falar sobre detalhadamente sobre eficiência sobre seletividade sobre retenção tá então num âmbito um pouquinho mais geral aqui olhando para essa equação né a gente tem basicamente que a retenção é a capacidade do seu analito de interagir com a sua fase estacionária tá Ah então a todo analito todo eh composto de interesse ele precisa ter uma interação com a sua fase estacionária caso ele não tenha nada de interação com a sua fase estacionária você não tem simplesmente como separá-lo você

vai ver numa equação que eu trouxe aqui para vocês num gráfico aliás que quando você não tem retenção você não tem nada então você precisa provocar a retenção do seu analito eh com a sua sua fase estacionada inclusive é um dos pontos de decisão né de de seleção de colunas cromatográficas eh um composto hidrofóbico por exemplo também precisa passar por uma coluna que tem a capacidade de interagir hidrofobico com o seu analito tá a seletividade é a capacidade de diferenciação entre dois analitos tá então é a a capacidade de separação deles diretamente né aí eficiência

é o quanto você consegue tirar esse esse pico cromatográfico esses analitos da sua coluna de uma maneira sem ter distúrbios no sua separação então quanto maior é o distúrbio a turbulência na separação cromatográfica menor é a sua eficiência tá olha só que interessante isso aqui assim como a a calculadora de colunas esse esse gráfico aqui pessoal é um dos gráficos mais importantes de serem entendidos tá Ahã Ah já respondo aqui Fernando tô vendo aqui seu comentário tá só não vou perder a linha de raciocínio já já eu paro daí a gente responde aqui tá ali

ali também eh do pessoal que já usou né ou da Célia que ainda não usou a ferramenta de eh calculadora de de colunas Que bom aí tá que tá sendo útil para vocês mas para não perder aqui só um segura um pouquinho Fernanda rapidinho só para não perder aqui a a a informação né e o fio da meada aqui o que eu falei para vocês é o seguinte né então nós temos que a resolução cromatográfica Ela depende da eficiência da retenção e da seletividade quando esses três fatores estão em harmonia você tem a melhor separação

possível pro seu pico desejado porque basicamente você precisa que ele esteja separado dos demais agora quando você tem inúmeros Picos que você eh precisa separá-los aí você tem um baita de um problema mas só que você tem inúmeras ferramentas para isso também olha só que interessante isso daqui tá a resolução Ela depende desses três fatores Mas qual o fator de fato influencia mais eh na na resolução na separação cromatográfica eu acho que dá para começar a falando para vocês reforçando que para que tá vendo o gráfico azul aqui então o o k que significa né

o fator de retenção aqui eh para você ter um mínimo de separação cromatográfica você precisa pra ter também um mínimo de retenção se você tem um mínimo de retenção Aí sim você pode trabalhar na eficiência na seletividade dessa coluna cromatográfica caso você não tenha retenção é você não consegue separar tá então parta sempre do princípio que a primeira decisão que você tem que tomar é de que você precisa forçar a retenção do seu analito na sua coluna cromatográfica Depois disso você tem a eficiência em que pode ter um Impacto né lembra-se lembram-se né que na

aula passada a gente vinha falando quanto menor o tamanho da partícula maior a nossa eficiência cromatográfica e de fato quanto maior é a nossa eficiência cromatográfica quanto mais fino é os são os nossos Picos mais fácil é da gente conseguir separar os dois eh compostos de interesse um em relação ao outro só que quem influencia de fato na resolução de uma maneira muito grande é o fator seletividade por quê Porque esse fator seletividade ele tem a capacidade de fornecer pontos de interação paraa sua molécula e baseado nesses pontos de interação que a gente vai ver

a gente consegue ter retenção diferente dos determinados analitos tá é um dos gráficos mais interessantes que a gente tem aqui porque esses eh pontos aqui de seletividade que most são mostrados aqui embaixo eh também podem ser vistos dentro da a seleção de colunas noos sites dos Fabricantes tá na aula que vem eu vou mostrar para vocês como comparar colunas diferentes fabricantes para tomar a decisão de uma maneira um pouco mais assertiva tá eh então Eh o que que acontece aqui na na na seletividade olhando só pro fator seletividade agora Quais são os fatores capazes de

alterar a seletividade a gente vai falar hoje só de colunas cromatográficas então eu trouxe para vocês aqui as diferentes colunas cromatográficas que a gente tem eh no mercado né com possibilidades de uso no nosso HPC mas saibam que a seletividade ela também pode ser influenciada baseado no PH no gradiente da sua fase móvel na temperatura da sua coluna cromatográfica e no solvente orgânico hoje nós vamos falar só de coluna cromatográfica tá então saibam que a seletividade na próxima aula a gente vai falar eh sobre eh fatores que influenciam na separação cromatográfica e aí sim a

gente vai falar um pouco mais sobre solventes Gradiente PH e temperatura aqui tá Ah Deixa eu responder aqui a a Fernanda antes de seguir aqui que a gente tem agora um guia prático de seleção de colunas aqui tá a farmacopeia Americana pede o sistem de razão o pico Vale de 10 mas separa tão bem que nem calcula o pico Vale como D um resultado que não é calculado olha excelente pergunta viu Fernando porque assim eu acredito que teria que nesse caso olhar pro seu cromatograma para poder avaliar ele de fato porque quando a gente eh

vai fazer o processamento dos dados a gente precisa levar em consideração alguns fatores Como qual é o fator de linha de base né O trold que você tá utilizando eh e também alguns outros paretos de integração Então nesse caso como ele tem uma particularidade muito grande a gente teria que olhar de fato para como você tá fazendo o processamento isso influencia o software que você tá utilizando né então hoje a gente tem uma facilidade muito grande de uso e do software ow né O que mais a gente tem conhecimento aqui disparado por conta de ter

uma relação muito próxima com a empresa Wats né inclusive nós temos o Bruno aqui do nosso time de de Educacional Ele é especialista nessa linha de treinamento do software empower tá então o que que eu vou te pedir aqui uma ajuda Fernando se você quiser passar pra gente os detalhes tem o meu e-mail aqui no final dessa apresentação que eu tô mostrando pode entrar em contato com a gente a gente te auxilia te orienta pode eh discutir um pouco mais sobre porque eu acho que é complexa essa sua pergunta tá ela pode eh ter uma

relação com o que você tá fazendo na prática né no detalhe mesmo do seu cromatograma tá trouxe aqui para vocês um guia prático de seleção de colunas para facilitar a vida de todos nós aqui né então pensem comigo uma seguinte situação né isso aqui pessoal é um guia bem prático simples na verdade baseado na polaridade da sua molécula vocês vão ver né quem já faz a parte de cromatografia eh vocês já sabem na verdade que quando você vai desenvolver um método primeiro lugar que você olha é pra molécula que você quer separar e lá da

molécula você vai tirar informações como tamanho dessa molécula polaridade eh ah você vai tirar eh inúmeros eh pontos ali dessa dessa molécula capacidade de ionização ou não Como que essa molécula pode se comportar na na sua fase móvel se ela precipita ou se ela não precipita e baseado nessas informações você vai decidir qual eh técnica de separação você vai utilizar se for a cromatografia líquida no caso a primeira coisa que você tem que olhar é pra polaridade eh da dessas moléculas porque se você tem uma molécula com característica Apolar você rapidamente vai ter a necessidade

de retê-la e para retê-la você precisa levar em consideração quais interações essa molécula faz com a sua fase estacionária então basicamente Você tem uma árvore decisória aqui né baseado nas Car características dos compostos de qual coluna você utilizar né a gente passar pra frente aqui fica um pouquinho mais visual né E agradeço aqui alguns catálogos tanto da Wats quanto da merk né que me forneceram esses eh essas informações dessas figurinhas né mas quando a gente fala de ligante aqui é inevitável na verdade a gente olhar né essa vontade de pegar né o o visual né

de Olha quando eu falo de uma coluna c18 o que que é de fato uma coluna c18 né ah thago é uma coluna que tem a base de sílica ligada a 18 carbonos legal e esses 18 carbonos eles vão conferir uma determinada polaridade paraa Nossa fase estacionária Opa é isso então sim é isso que significa tá hoje nós vamos falar aqui sobre algumas características e particularidades específicamente sobre as colunas C8 shield RP c18 ac c18 também eu acho que a gente a gente vai pisar em alguns detalhezinhos das demais mas na próxima aula a gente

vai se ater às eh colunas com características levemente polares e também polares aqui tá hoje nós vamos se ater a a fase estacionária com características apolares e aí convido vocês a tirar algumas dúvidas aqui que são muito importantes isso aqui é pergunta de prova que eu tive inclusive lá na época do doutorado fazendo a disciplina de cromatografia eh com professor jesuí grande Professor jesuí aprendi muito com ele mas tinha uma pergunta Exatamente isso Por que que as colunas c18 C8 representam a maior quantidade de análise hoje né no mercado né então aqui nessa aula se

você tá começando na cromatografia ou então se você tem bastante conhecimento você vai aprender comigo aqui e responder essa pergunta vai responder também o que significa Lad Carbon e o que influencia na sua separação cromatográfica a como base de ligante também influenciando na separação O que é Hand Cap talvez vocês já tenham escutado esse nome O que é coluna shield RP 18 o que são e como funciona eh o uso da fase móvel altamente acosa numa coluna c18 vocês devem escutar né olha essa coluna você não pode usar 100% de água não existe isso então

por qu vou mostrar para vocês o que é um colapso hidrofóbico como evitar danos nas colas e também e a gente vai responder ao final se todas as colunas c18 são iguais e aí já convida vocês a me ajudar a responder isso daqui vocês acham que todas as colunas c18 são iguais ou não confesso para vocês que a gente recebe e inúmeras informações sobre colunas cromatográficas e muitas vezes vem e preciso de uma coluna c18 aí toda vez que eu eh vejo uma pergunta como essa eu paro e penso né mas qual que será que

é a sua aplicação né Porque de fato podem existir inúmeros tipos de coluna c18 né que é o que a gente vai ver e para vocês vocês acham que colunas 118 são todos iguais ou não o que que vocês acham Vamos aprender no detalhe O que que é uma coluna c18 Olha só isso aqui é o estado da arte né da do do aprendizado tá tomando uma aqui pessoal eh então a coluna c18 pessoal ou também nomeada oct decil o oct deil c c18 é constituído de uma cadeia de 18 carbonos por isso c18 né

então 18 carbonos ligados com eh a Gas ligados né com hidrogênios ligados a esse carbono tá primeira fase mais utilizado no hplc interessante quando os analitos são apolares né Vocês vão notar nas metodologias que moléculas polares como glifosato por exemplo tá muito em alta sempre não consegue ser retida uma coluna c18 tá possui alta eh elevada lipofilicidade possibilita alta retenção de compostos apolares de cadeia linear Por que que tem essa informação aqui porque você pode ter compostos eh eh apolares mas que não t cadeia linear e aí esses compostos eles não interagem entanto com o

c18 para isso foi desenvolvido alguns outros ligantes como por exemplo os fenil exil os bifenilos eh alguns outros eh ligantes que conferem interação diferente da interação hidrofóbica de cadeia eh longa do seu analito com a cadeia longa do seu eh c18 aqui tá então o oct decilo ou c18 é comumente usado pois a fase hidrofóbica altamente robusta que produz boa retenção de moléculas e analitos hidrofóbicos não polares esta fase também pode ser utilizada na separação de compostos polares quando utilizados com aditivos na fase móvel ou em colunas que suportam errado de suporte 100% diário tá

eh colunas que conseguem ter até 100% de água aí você vai falar Tiago mas existe ti de coluna existe tá eh e a gente trabalha com uma coluna chamada T3 vou adiantar aqui para vocês e essas colunas T3 c18 aguentam 100% de água e separam compostos polares muito bem vou falar sobre ela na próxima aula tá eh em geral o encurtamento da cadeia alquil né sc18 encurtado ou seja uma C8 uma C4 reduzirá o tempo de retenção dos compostos apolares existem apenas diferenças de seletividade muito pequena entre por exemplo coluna C8 e c18 a utilização

dos fases estacionárias mais polares como as fases Ciana fenil a mina apresenta seletividade alterada em relação às fases alquil essas fases são capazes de interagir com grupos funcionais de analitos polares por meio de interação de Polo de Polo com a coluna fenil interagindo em porções aromáticas do analito através de interações eletrônicas pipi por exemplo então lembra que eu falei aqui ó que a alguns essa coluna aqui ela possibilita aor retenção de compostos apolares de cadeia linear Porque caso você tenha alguns compostos polares de cadeia eh fechada pode ser que você não tenha uma interação tão

adequada E para isso você pode ter uma coluna fenil por exemplo tá ou então algum outro tipo de coluna para lançar a mão dessa separação mais adequada tá ainda pensando em compostos apolares tem outra tipo de coluna com característica polar que é a octil ou octil Cil que é a C8 tá constitui de cadeia carbono de oito carbonos por isso C8 segunda fase mais utilizada em hplc interessante quando os analitos são extremamente apolares aqui mas você não consegue não precisa não tem uma necessidade de retenção absurda você não precisa de um tempo de retenção muito

alto Então vale a pena lançar a mão de uma C8 ao invés de uma c18 possui elevada e felicidade no entanto menor que a c18 possibilita moderada retenção para compostos apolares de cadeia linear aqui tá uma um exemplo né da nossa C8 tá E aí quando vocês olham para essa cadeiazinha aqui ó que eu trouxe para vocês eh existe uma informação pessoal que é muito importante que influencia na prática na hora de decidir por uma coluna c18 ou por uma C8 ou então diferenciar coluna c18 de diferentes fabricantes ou de diferentes nomes comerciais que é

a carga de carbono é possível você olhar nas especificações da coluna e encontrar essa informação chamada Lad Carbon essa informação chamada low Carbon refere-se a porcentagem em peso do teor de carbono da fase estacionária ligada ao material de suporte em geral fase estacionárias são cargas de carbono mais altas de carbono mais alto resulta em mais superfície hidrofóbica e tende a reter analitos hidrofóbicos ou seja low de Carbon a porcentagem quanto maior densidade de carbono maior a retenção de compostos e analitos hidrofóbicos E aí você tá lá desenvolvendo o seu método lá e o seu eh

composto interesse não fica retido na sua fase estacionária Aí você olha para ele você fala ele é um composto Apolar ele tinha que interagir com uma c18 Mas você vai olhar o Lad de Carbon tá em 4% E aí é uma densidade Alta ou baixa vou mostrar para vocês que é baixa a escolha de altas cargas de carbono para amostras complexas requerem um grau máximo de separação então algumas eh amostras como eh extratos de planta por exemplo pessoal que trabalha com fitoterápicos lá na farma ou então vocês que trabalham pessoal da Agro né Fabiano que

trabalha aí com uma um mix muito grande de compostos e precisa separá-los e tem uma característica hidrofóbica eh moléculas levemente básicas ou levemente ácidas querem empregar uma separação maior dá para direcionar para uma coluna de low de Carbo maior eu vou mostrar para vocês onde encontra essa informação escolha baixa eh baixo cargas de carbono dá para dar tempos de análise mais curto também é um um ponto de decisão para misturas de amostras ou para amostras e para noas que requerem um al teor de água para solubilidade e estabilidade na prática Você precisará de duas ou

mais colunas diferentes para testar eh de acordo com a sua amostra e definir a melhor opção do desenvolvimento de método durante o desenvolvimento de método pessoal é evidente que se você tiver uma gama de colunas para poder decidir qual utilizar é muito melhor né E inclusive colunas com características ortogonais que a gente chama né então coluna c18 C8 uma coluna fenil uma coluna eh T3 por exemplo que continua sendo c18 mas com a possibilidade de uso de uma alta taxa de água por exemplo conseguindo reter compostos polares e uma coluna hilic por exemplo para inverter

completamente a polaridade dessa coluna e tentar aderir essa essa determinada molécula quando você tem essa Gama de pelo menos cinco colunas diferenç na mão fica muito mais fácil você desenvolver um método mas a gente sabe sabe que às vezes Ah o custo disso né é um pouquinho mais elevado então na prática e para deixar um pouquinho mais visual né Eh quando a gente olha para ligantes e base de ligantes né então ó aqui tem um exemplo né aqui embaixo Ah que eu vou mostrar algumas coisas para vocês a primeira delas é que aqui do lado

esquerdo né eu tenho uma base ligante de sílica e o C8 aqui ó é acoplado a ele notem que o espaçamento entre o C8 aqui pequenas de ligantes São pequenas Ou seja a alta densidade de ligante de carbono então Tem muitos aqui ind detrimento em relação né a a uma coluna de baixa densidade de ligantes eu tenho esses ligantes muito mais espaçados então sua molécula vai entrar interagir com c18 e seguir né ainda queria chamar atenção para vocês aqui já fazendo um link com o próxima próximo assunto que é a o que a gente tem

além do ligante aqui na base do ligante né então existe uma coisa chamada eh silanóis Livres né então quando quando você faz a reação quando fazem a reação de de acoplamento aqui desses dos ligantes à base de sílica é inevitável que alguns eh ohs dessa sílica eles acabam não reagindo e nessa de não reagir eles ficam livre só que o seu analito entrando dentro da coluna tem um pouco de fé agora viagem comigo lá para dentro da coluna o analito entrando na coluna passa dentro do pum entrou interagiu com o seu ligante só que cara

ele não vai interagir só com o seu ligante é um processo dinâmico e esse analita ele pode se ligar também e interagir com o silanol que tá livre só que para sua separação cromatográfica isso não é interessante isso não é legal o seu pick Shape a simetria de pico pode ser eh afetada diante dessa interação que não é desejada então existem interações específicas que você quer que aconteça interações inespecíficas o silanol Livre S faz parte de interações eh inespecíficas aqui ó vocês veem alguns tipos de grupamento que foi um mecanismo de ação feito pelos fabricantes

de capeamento de cobrimento dos silanóis livres então existem hoje colunas de alta densidade de carbono baixa densidade de carbono com diferentes elegantes existem colunas endc que é são colunas que TM um capeamento de silanóis Livres por qu para evitar interações inespecíficas do seu analito com a sua fase estacionária base do seu ligante tá então quando você vai selecionar uma coluna eh cromatográfica Além de olhar pro ligante é possível você olhar se ela é capeada qual é a densidade do seu eh carbono do Lad Carbon E além disso todas as outras informações que a gente já

falou como tamanho de partícula e capacidade de variação de PH de Range de PH vou mostrar uma tabelinha aqui para vocês no próximo slide acho que é no próximo mesmo ou no outro e isso mesmo estamos chegando lá da tabelinha de quais são as informações que você tem que ver tá mas pensando na nesse anois Livres né então falei da densidade de carbono falei dos silanóis livres e do endic aqui já eh apresentando ele aqui para vocês né E lá na reação da sílica como base de legante né paraa cromatografia de fase reversa aqui né

a reação eh ele pode passar né de alguns grupos eh sanol da superfície produz muitos eh ficam né durante essa clorocil iação que nada mais mas é do que a ligação do c18 lá no nosso eh na nossa sílica ela ainda sim pode ficar né presente pode ficar exposto ali igual eu falei né existem alguns processos de eh colocação de eh silanização dessa dessa base de partícula e existe uma máxima de que a Cloro silanização pode ser de monod tri clorocil e a gente sabe que as de itri elas eh respondem melhor conseguem evitar com

que fique ohs mais expostos tá E aí você vai falar thago e daí né O que que isso influencia para mim colunas com tecnologias mais avançadas de tecnologia recente eh lançada elas tendem a ter esse processo de cloro silanização já de ditre agora colunas mais antigas da época de 1990 80 aí você não tem você pode est tendo efeitos no seu cromatograma por conta dessa tecnologia caso fique alguma dúvida e queira você queira tirar essa dúvida e mandar pra gente falar assim ol thago meu cromatograma tá desse jeito a gente discute o seu caso junto

baseado na coluna que você tem para poder direcionar de fato uma uma coluna talvez com uma tecnologia um pouco mais adequada tá eh Seguindo aqui o nosso a a sílica ainda né de como como base de ligantes né a carga de carbono se refere a quantidade da fase ligada igual eu comentei né no material é usada para comparar c18 C8 e fases ligadas ao fenil eh carga de carbono geralmente não é utilizada ou não é levada em consideração para outros tipos de de ligantes tá a gente só considera para C8 c18 e as fenis tá

porque a porcentagem do peso de fase ligada é muito pequena nessas colunas aqui né cian Amina C4 C2 colunas de troca iônica tá valores de carga variam de aproximadamente 3% a 20% ou ainda maior em alguns casos muito específicos tá carga de carbono mais alta geralmente dão capacidade da coluna de maior resolução eh e execução mais longa mais orgânico será necessário na fase móvel para eluir as mesmas amostras de colunas eh com maior teor de carga nesse caso tá é evidente né isso aqui é muito claro mas a gente vai falar sobre fatores que influenciam

na seletividade na próxima aula eu falo para vocês eh Como utilizar a fase móvel aí para tirar de Fato né um analito de interesse lá da da fase da sua coluna cromatográfica na hora certa tá fiz questão aqui de trazer alguns exemplos rapidamente aqui tá pra gente não demorar tanto né com a aula como eu tinha prometido mas isso aqui é um exemplo de especificações de uma coluna xbd BH c18 eh de 130 anos comos tamanhos de partícula 2. 3.5 micrm 50 cm Olha só química c18 eh formato é uma coluna fase reversa né área

de superfície aí vou pular algumas informações aqui a base do ligante é híbrida né ou a fasta PH de 1 a 12 pode ser usada nessa coluna ela aguenta até 6.000 PSI existe uma classificação da USP né para diferentes colunas na próxima aula eu vou falar disso ã aqui olha só ó dentro das especificações da coluna ó load Carbon eí eu queria chamar a atenção de vocês aqui ó uma coluna1 não é essa aqui 3.5 Lou de Carbon 18 ó o exemplo dois coluna xbd BH C8 ó o Lad Carbon 13 e aí você vai

me falar thgo eu posso ter uma coluna C8 com load de Carbon 18 também pode também pode ser feita e aí você entende que e compreende que dependendo da decisão que você toma de comprar uma coluna c18 ou uma C8 você pode não ter diferença quase na separação e pode ter uma relação com o Lad Carbon nesse caso ou então evidentemente com todas as outras variáveis que você pode ter no seu método mas eh o load Carbon influenci muito aqui nesse caso tá E agora que Vocês entenderam Para que serve é bem importante que vocês

saibam aqui eu tenho uma coluna c18 também a cex T3 que inclusive aceita 100% de água na fase móvel e geralmente ela é utilizada para poder reter compost polares né compostos com características mais polares de fato desculpa gente deixa eu tsir aqui perdão pessoal veio uma tosse aí de tomar um golinho daágua aí Maravilha Olha o low Carbon dessa coluna T3 que aguenta 100% de água e vocês vão ver que tem uma é algo proposital aqui não é algo aleatório eu vou mostrar para vocês o porquê aqui a gente não falou lá atrás que a

gente ia descobrir Por que que pode acontecer colapso hidrofóbico O que que tem a ver eh você ter um capeamento da da da da base do do ligante eh acho que mais relacionado nesse caso aqui de fato ao colapso hidrofóbico Mas ó o l de Carbon aqui essa coluna é uma coluna com característica Apolar porque é uma c18 só que noad Carbon dela 4.7 ela tem muito pouco é ligante E aí você tem a possibilidade de usar de fato aqui uma fase móvel uma característica muito polar que é a água em 100% sem colapsar sua

coluna cromatográfica e essa decisão aqui né de uso Por que que eu uso uma T3 e e eu não uso uma c18 convencional com l de Carbon 18 depende depende da característica da minha molécula se é uma molécula muito hidrofóbica talvez você ter e você quer que ela fique retida muito tempo direciona para uma coluna c18 padrão low Carbon 18% agora moléculas características mais polares que você não tá conseguindo reter ela direciona para uma T3 talvez você tenha sucesso tá eh Seguindo aqui tá a gente tem ainda alguns slides aí pela frente né Eh queria

mostrar para vocês agora no detalhinhos né dos silanóis livres ou não né então a gente já falou ã ali atrás né eu mostrei rapidamente para vocês o o capeamento né O que que é o capeamento de uma de uma uma coluna né Deixa eu ver se tá escrito aqui end Cage eh eu não consegui encontrar aqui essa informação acho que não tem ó se ela é capeada Geralmente vem aqui também aqui ó achei ó essa aqui é uma coluna c18 com capeamento além de tudo então tem os c18 E tem também o bloqueio dos silanóis

livres mas o que que influencia pra gente né esses silanóis livres de Fato né esses silanóis Livres eles podem interagir com suas moléculas evidente que não todas as moléculas Mas algumas moléculas em específicas sim ele pode interagir o que que acontece para mim na prática ti acontece que o seu pico cromatográfico Ao invés dele ficar simétrico ele passa a ter uma cauda né um tailing e os Picos na verdade a gente deseja que eles tenham é uma simetria exata quanto mais simétrico eles tiverem mais fácil é a minha separação cromatográfica ou Além disso além da

Separação cromatográfica a minha reprodutibilidade caso eu não tenha isso quem aqui já teve problema né com pico arrastado quem nunca teve né porque eu já tive várias vezes durante desenvolvimento de de met ó Fabiana acontece bastante e aí Fabian olha só que interessante né Eh já já direcionaram e resolveram eh essa situação pra gente né existe algumas alguns mecanismos de de defesa né da do fato de ter né um um grupamento possível de reagir com a sua molécula de interesse né os silanóis livres que ficam aqui na base do ligante eles tendem a ter uma

relação né de perda do seu hidrogênio e nessa relação de perda do hidrogênio eles podem se ligar geralmente Aqui Acontece de ter uma carga geralmente Aliás ele vai ter uma carga negativa né e geralmente compostos capazes de estarem eh ionizados no modo positivo vão acabar interagindo e aí se você pegar eh qual classe de de moléculas conseguem de fato manter ali a interação você vai chegar à conclusão que moléculas com características levemente básicas tendem a interagir com esses celan nóis livres e acabam gerando um cromatograma com picos arrastados com tailing com calda tá então tem

algumas maneiras da gente prevenir esse esse efeito aqui de tailing né vou voltar aqui rapidamente só para mostrar para vocês então a gente teria algumas alternativas né Aqui tá o ligante aqui o silanol livre essa molécula vai entrar e interagir aqui com o meu silanol livre Então ou eu bloqueio essa molécula aqui ou eu faço um escudo aqui ou então eu deixo ela solta né nas e colunas de tecnologia mais antiga isso aqui tá solto e vocês já devem ter visto algumas metodologias compendia inclusive que com o uso de um aditivo chamado triaton Amina Vocês

já viram isso aí ou não E quem já usou aí quem tem um um método aí que usa triet Alon Amina sabe adivinha só para que que é essa triet Lon Amina para ela vir se ligar aqui nesse silanol livre e aí você não tem interação do seu analito no momento de separação cromatográfica entende então para evitar isso foi feito ou o capeamento o o end caped né as moléculas as colunas end caped né para proteção dos silanóis livres éo a molécula não interage com ela ou então foi criado uma coluna cromatográfica chamada shield RP

c18 esse shield é de escudo Então essas moléculas Elas têm essas colunas cromatográficas eu vou mostrar elas ali para vocês tem a capacidade de proteção desse eh silanol livre baseado na formação de um escudo de água da sua própria metodologia de fase reversa Então se a gente eh olhar para para para pra superfície tem que ter um pouco de fé aqui de novo né então falei para vocês que tem três maneiras diferentes né Vocês já conheceram o capeamento o handcap tem como você e utilizar um aditivo para bloquear essa esse silanol livre ou então tem

como fazer um escudo de água aqui tá só que para fazer o escudo de água a sua aqui tá a base do ligante tá sua seu ligante aqui e aí tá aqui ó seu C8 tá vendo ó C H2 parênteses 7 e um ch aqui tá vendo que tem uma outra molécula aqui ó com característica muito polar tá essa essa molécula aqui com característica muito polar ela atrai a água para formar um escudo e proteger esses silanóis livres e a sua molécula de interesse aqui ó ela acaba não conseguindo entrar então existe coluna c18 sem

capeamento existe coluna c18 com capeamento para minimizar a interação do silanol livre e existe coluna RP c18 essa Eh desculpa shield RP c18 essa coluna shield RP c18 tem além do c18 ou do C8 uma molécula polar capaz de atrair água para formar um escudo aqui presente e aí se quando você comparar analiticamente essas três eh colunas essas três eh situações Você pode ter fotogramas totalmente diferentes e aí você tem às vezes muitas vezes né algumas moléculas eh algumas eh situações em que você tem Ah vou fazer aqui ti tô desenvolvendo um método e eu

tenho uma c18 e eu tenho uma c18 shield RP e eu tenho uma c18 an Cap a outra tecnologia mais antiga mas isso aqui tudo é c18 olha não é tudo c18 dependendo da situação de como você for utilizar se você tentar reproduzir a mesma metodologia você não vai conseguir Muito provavelmente as mesmas metodologias aqui é um comparativo entre diferentes colunas com características semelhantes eh só que com sem capeamento capeamento e com a molécula polar capaz de formar um escudo na sua eh região assim como nessa figura aqui na sua região mais próxima de proteção

eh do silano Livres não vou falar aqui sobre a metodologia gostaria de chamar atenção para vocês aqui ó sobre o esses cromatogramas né E aí notem que aqui estão as moléculas ó uracil propanolol nortriptilina doxepina amitriptilina trimipramina eh essas quatro últimas moléculas aqui elas têm características de serem eh levemente básicas se vocês procurarem vocês vão descobrir uracil que tem quase nada de retenção numa molécula c18 e o propanolol eh que eu não me lembro aqui exatamente mas eu acredito Com certeza ele não é uma molécula básica deve ter característica ácida tá E aí o fato

dessas moléculas eh terem a característica básica Elas têm a capacidade de formar esse íon aqui e interagir com os silanóis que estão livre aí olha só o que acontece com os seus Picos então vendo o pico aqui embaixo de uma não capeada totalmente arrastado os Picos eh TR 4 5 e se de um de uma coluna capeada em relação a uma coluna eh com o escudo então para você decidir qual coluna utilizar primeiro você tem que olhar paraa sua molécula mas caso vocês tenham algum tipo de molécula básica com característica básica que vocês queiram separar

é quase que inevitável vocês irem para uma Shield c18 tá eh digo isso porque vocês podem estar tendo atualmente aí nos seus métodos alguns Picos com tailing alguns Picos com arrastamento de de banda e pode ser uma relação de interação com silanóis Livres eu digo pode ser porque pode ter outros problemas relacionados a a tailing tá existe um uma uma maneira da gente olhar paraa resolução de problemas existe várias coisas possíveis de serem eh eh de acontecerem com o pico tá beleza queria mostrar essas três diferenças para vocês queria fazer questão de de trazer para

vocês para para vocês entenderem que de fato a a decisão de seleção de uma coluna c18 C8 ela não é simplesmente pelo nome dela tem muita coisa que influencia baseada no mecanismo de separação tá hoje vocês estão aptos já aqui a tomarem essa decisão de uma coluna C8 c18 pelo menos tá É lógico se vocês têm bastante conhecimento aí muito conhecimento no desenvolvimento de método né E e esse essa informação já vem vem a mais para agregar uma informação que é muito pertinente para passar para vocês quem tá começando né na cromatografia é falar um

pouquinho sobre o risco que tem de uso na coluna cromatográfica c18 C8 de uma fase móvel e acosa de 100% né ou maior que 95% de água que que acontece na prática né a tendência quando a gente usa uma coluna c18 ou C8 que caracteriza uma cromatografia de fase reversa a gente tende a utilizar e começar um uma análise com altos eh valores altas proporções de água no método por quê Com altas proporções de água a gente vai procurar e tentar reter o máximo possível as moléculas na nossa coluna né então a água seria considerada

uma fase móvel fraca de eluição E aí depois a gente vai empregar um maior volume de solventes orgânicos acetonitrila metanol e THF para poder eluir Esse tirar realmente esses compostos da sua fase estacionária E aí sim poder determiná-los lá no nosso detector tá eh só que paraa coluna ser1 A gente tem que tomar muito cuidado porque quando a a gente tem uma alta proporção dissolvente acoso na na nossa coluna cromatográfica a gente corre o risco de ter uma coisa chamada colapso hidrofóbico a gente corre o risco de danificar a sua coluna ela perde completamente a

capacidade de separação ela perde a capacidade de seleção de resolução cromatográfica e E além disso pessoal várias aplicações modernas de PC né Elas requerem essa essa alta volume né de água lá na coluna né Por exemplo as técnicas de eh análise né de lcms pela fonte de eletros spray né que é muito usada atualmente né Eh ela elas são eh muito boas as análises quando você tem eh uma alta proporção né dis solvente acoso tá então para para você usar uma coluna c18 e manter essa alta proporção talvez você tem que decidir por uma segunda

coluna as colunas de fase reversa tradicionais não são adequadas para uso de fase móvel altamente acosa devido a um fenômeno conhecido sobre o colapso dos sítios ativos fase ligada de hidrocarbonadas para escapar da fase móvel altamente polar resultando nas perdas brutas de eficiência as colunas podem ser restauradas mas somente após procedimento de lavagem de colunas longos e complexos tá é um paradoxo né faz reversa é feito feito para conquistar uma retenção de compostos apolares Mas é uma forma eh cromatográfica que é muito utilizada nos equipamentos e todos preparados para fase reversa solventes menos tóxico etc

mas para análise de compostos polares há uma um grande desafio em conquistar a retenção D compostos polares nas colunas de fase reversa eh eu vejo um movimento muito grande dos Fabricantes de coluna nesse sentido aqui desenvolver colunas cromatográficas capazes de reter compós pooles de fato tá eh sabemos que por eh que quanto mais solventes orgânicos na fase reversa menos retidos composto fico então ess se eu usar 100% tiagua na fase móvel né para reduzir a força solvente orgânico o que que acontece thago eu tenho o risco do colapso hidrofóbico eu corro o risco do solvente

que embebeda aqui né que fica eh na relação realmente com o poro dele ser expulso porque vocês concordam comigo que numa c18 isso aqui é muito Apolar E aí se eu tenho um um solvente polar tentando entrar que é a água no caso e eu não tenho como retê-los aqui dentro reter Essa água aqui dentro ela chega um ponto de não entrar mais dentro do poro Por que que isso acontece porque angulatus né entre água metanol acetonitrila tetra í Furano você consegue ver que a água é muito mais viscosa né e além dessa apolaridade do

poro ainda tem essa capacidade de molhabilidade do poro que a água não tem E aí quando você tem 100% de água tentando entrar nesse poro ela não tem angulatus adequada ela não consegue permear o poro e ainda tem os ligantes com característica Apolar expulsando completamente essa essa fase móvel lá de dentro e aí o que que acontece na prática os ligantes que são feitos para interagir com o seu analito eles acabam interagindo entre eles e aí a sua fase estacionária colapsa completamente tá como resolver e um problema como esse tá a gente tem ã hoje

já o lançamento de algumas colunas eu vou falar sobre e aqui fica já meu convite para vocês não deixarem de assistir a próxima aula sobre colunas cromatográficas também eh antes da gente ir para fatores de seletividade né de fato porque lá eu vou falar no detalhe sobre os outros ligantes e vou falar sobre a coluna T3 também que é uma coluna que tem a capacidade de fato suportar 100% de água mesmo sem eh perder a capacidade de resolução então o gráfico A e B são eh análises feitas com coluna c18 T3 com 100% de água

inicialmente né e que eh mesmo depois de parar o fluxo e voltar a ativar ela demonstra uma seletividade uma resolução tão boa quanto a primeira análise contrário de quando você usa uma c18 comum esquece uma c18 com 100% de água dentro para você ver o que que acontece depois quando você for utilizar novamente você não vai conseguir você não vai ter resolução seu pico Vai ficar muitas vezes quebrado por quê porque acontece isso aqui ó colapso da sua fase estacionária Beleza então para resolver isso ou você não utiliza água 100% ou você utiliza uma coluna

adequada mas caso venha acontecer Fica aqui minha recomendação de resolução de problemas para vocês peguem essa coluna coloquem 100% de acetonitrila ou metanol na fase móvel um fluxo muito baixinho passando por essa coluna durante 24 horas É isso mesmo você escutou durante 24 horas deixa um fluxo de 0.05 ml por minuto passando por essa coluna por longa data esse solvente ele tende a entrar dentro do poro reestabelecer esses ligantes que estão lá dentro eh para poder interagirem novamente com a sua com o seu analito de interesse combinado Caso vocês não consigam recuperar a coluna daí

inevitavelmente né quase que realmente só trocando elas pergunto novamente depois de tudo isso que a gente viu né existem colunas c18 Eh desculpa colunas são c18 São Todas Iguais consigo dizer com muita clareza para vocês que não são todas iguais a gente tem que tomar muito cuidado na hora de selecionar essas colunas Porque de fato ela vai influenciar na sua separação e se você escolher errado você não vai conseguir eh ter sucesso analítico tá Caso vocês tenham pessoal alguma dúvida na hora da seleção de colunas vai ser uma satisfação muito grande poder trocar mais informações

com vocês Vocês podem nos procurar Não só eu aqui né que que tô aqui ministrando a aula mas hoje no time da Matrix a gente tem Inúmeras pessoas capacitadas para poder direcionar a melhor coluna possível paraa sua etapa analítica e vai muito além disso a gente contribui diretamente muitas vezes pro desenvolvimento implementação dos métodos também queria deixar aqui uma mensagem para vocês que vocês podem contar eh com a gente tá volto a repetir né Assim como na primeira aula eh que fico muito feliz que tem muitas pessoas aqui acompanhando né a jornada da cromatografia né

vivenciando aqui com a gente essas etapas Eu sei que vocês têm os compromissos de vocês mas cromatografia é uma construção de Fato né faz algum tempo que eu já tô na na caminhada eu conheço Inúmeras pessoas aqui que tem uma caminhada muito longa muito legal aqui na linha de cromatografia e é um aprendizado contínuo hoje a gente aprende um pouquinho hoje a gente estuda um pouco mais e a gente vai aprender né aula um aula dois aula três aula quatro e o objetivo aqui desse canal é esse passando conhecimento trocando algumas informações igual a Fernanda

trouxe aqui uma dúvida eh muito pertinente como teve a colocação aqui de outras pessoas na nas aulas também Fabian aqui sempre com a gente também e é esse o objetivo pessoal eh não se acanhe a comunidade de vocês a gente sempre quer trocar mais informações tá porque a gente que entende que dessa forma a gente de fato cresce tá E aproveito aqui para deixar para vocês eh ainda mais um uma palavra de motivação né hoje existem muito poucos profissionais capacitados para uso do hplc de uma maneira que consigam desenvolver métodos adequados que consigam eh utilizar

os cromatógrafos e e chegar a um sucesso analítico de fato e o mercado de trabalho tá olhando muito bem para isso para remunerar bem para te alocar em uma posição adequada tá então acreditem que e de fato o conhecimento vem e o trabalho devolve né devolve bastante realmente tá eh antes de de responder a a pergunta el Deixa eu só dar um recadinho aqui né Não deixe de assistir as próximas aulas a próxima aula do Bruno de CG é de seleção e manutenção de colunas para para CG também vai falar de colunas e manutenção lá

das cgas né pessoal eu tive que fazer aqui eh mais uma uma aula de colunas cromatográficas e suas especificações agora parte três eh eu o Orlando tá avisando aqui que o formulário tá com erro eu vou vou verificar já eh aqui Orlando só vou finalizar a aula eu já verifico aqui para vocês tá essa questão do formulário aqui já resolvo instantaneamente tá assim que acabar tá segura só um pouquinho qualquer coisa depois pode mandar mensagem no WhatsApp que eu que eu respondo beleza Eh mas eu queria dizer aqui para vocês que a gente finaliza aí

as aulas de colunas cromatográficas na próxima porque o assunto é longo aqui já deu para perceber né Eh participem com a gente lá dos grupos do Chrome do do WhatsApp do do telegram Pô muito legal tá com vocês lá a gente manda o material semanalmente vocês podem baixar os chroma tips que são materiais interativos também eh de informações escritas de uma maneira um pouco mais coloquial até para vocês entenderem um pouco melhor de como funciona a cromatografia tá Ah queria aproveitar para pedir para vocês aqui né curtir esse vídeo e e seguir a gente aqui

no canal é muito importante paraa gente tá só um lembr e Ah deixa eu deixa eu movimentar aqui minha tela aqui que eu vou mostrar uma coisa para vocês ó de novo concurso de sorte do nosso parceiro aqui dessa vez a Wats tá caderno Fantástico aqui tá vou disponibilizar para vocês vai ter o nosso bloquinho aqui de anotações também uma caneta da Matrix para quem preencher o formulário aqui tá e responder corretamente palavra-chave a gente vai fazer o sorteio pessoal aqui da Matrix vai enviar para vocês gratuitamente esse brindezinho porque eh pô hoje é muito

legal estar com vocês aqui tá caso que alguém queira né sair do básico pro avançado no no hplc a gente tem um curso de hplc chamado hplc com propriedade você encontra o link aqui na descrição do vídeo tá curso bem completo 26 aulas 28 horas aula com muito material muito mesmo eh a gente tem além das aulas Todo o material em PDF disponível cara tá barato tá barato dema esse curso quem quiser aí vá lá tá eu vou responder aqui as as as perguntas tá E só um pouquinho Beleza deixa eu passar aqui e palavra

chave de hoje não podia ser diferente né Vamos de c18 tá então repetindo a palavra chave de hoje para confirmar aqui C1 então preencha o formulário que eu vou arrumar já já orando ver o que que ele pode est dando de problema eh e eu eu disponibilizo lá para vocês o formulário tá palavra chave para quem quer receber o certificado de participação c18 combinado é isso pessoal minha meus contatos aqui né contato do time da do chrom também fique à vontade para entrar em contato com a gente vai ser uma satisfação poder responder vocês deixa

eu ir aqui paraas perguntas agora eh pra gente de fato ver aqui o que que que que eu posso responder para vocês aqui ajudar vocês tá então deixa eu voltar aqui nas perguntas eh pom obrigado pelo feedback né antes de mais nada excelente aula Show de aula Obrigado Meri grande abraço thgo no caso de utilização de tampão na fase Model para retirar retirar dessa fase eh pode usar água eh água com acetonitrila no caso então Respondendo a sua pergunta Lisangela Pelo que eu entendi é que se você tem uma coluna C 18 você tá usando

tampão aí poxa eu não posso usar 100% de água então eu tenho um ponto ali de eh que não que não converge né então o que que eu faço Olha eu vejo bastante gente utilizando eh uma solução de 95% água 5% acetonitrila ou metanol tá e você poderia usar até uma proporção um pouquinho maior de solvente orgânico também bem que ainda assim eh você não precipitar ou não tende a precipitar tampão na sua e coluna cromatográfica e você Evita o colapso hidrofóbico tá então minha recomendação é deixa uma solução preparada de 95% água 5% acetonitrila

ou metanol o solvente que você tiver utilizando sem tampão E aí você deixa passando por bastante tempo vou mostrar na próxima aula como calcular o volume eh da coluna e lá a gente calcula em volumes quantos volumes de coluna você precisa passar no mínimo para poder limpar essa coluna mas quando eu falo bastante tempo é num fluxo de 05 m por minuto pelo menos meia hora 1 hora quando você usa tampão el Não tenha medo de deixar limpando esse hplc e a coluna por bastante tempo porque garante de fato que você elimina tudo que é

possível ali de possibilidade de de precipitação tá Fabiano Muito obrigado Fabio formulário Orlando eu vou arrumar o formulário agora acabando a aula aqui se tiver algum erro eu já mudo lá tá o Ivo confesso que primeiro momento as informações são confusas para quem não tem experiência mas sig perseverando um forte abraço obrigado pela aula Ivo realmente cromatografia tanto líquida quanto gasosa é muito confuso porque não é tangível a gente tem a impressão de que não vai aprender nunca Cara essa questão sabe Mas como que que eu recomendo Ivo assim que acu comigo isso no começo

cara não entendi direito por onde começar o que que eu poderia fazer ou que eu não poderia fazer só que aos pouquinhos eu fui fazendo uma alternação entre estudos acompanhando algumas pessoas que eu sabia que tinha conhecimento em cromatografia investi em cursos e treinamentos também e fui pra prática Esse é o ponto principal aumenta seu conhecimento de informações livros e at né para essa linha de cromatografia só que vai um pouquinho pra prática também porque a hora que você vai pra prática fica mais tangível como que a coluna opera Qual que é o gradiente que

você usa Por que que você usa uma determinada fase móvel por que que você usa um determinado detector E aí começa a ficar mais palpável e aí nesse momento você volta para estudar um pouco mais e assim você vai aos pouquinhos Tá mas realmente é muito confuso confesso que no começo foi muito complexo aí tudo para mim também tá eh tem alguma forma de ter os materiais das primeiras aulas Maurício eh os materiais seriam os chroma tips e os as a gente tinha criado alguns mapas mentais por favor Maurício Entra lá no grupo tá do

telegram e do do do WhatsApp eu vou enviar todos os os materiais para vocês lá de novo tá então entra lá caso você não esteja eh tá bom eu vou acabar aqui já vou meer no formulário beleza um segundinho tá só vou finalizar a aula aqui combinado 9 hor já vou fechar gostaria de saber que mais aqui tem alguma forer gostaria de saber sobre RP da Hamilton que é para troca ou pareo iic tem conhecimento nessa coluna tá eu não cheguei a utilizá-la Ainda não eh cheguei a ler sobre ela mas eu vou procurar essa

informação e trago na próxima aula tá vou até anotar aqui e aí eu trago na na próxima aula beleza essa informação então é a coluna deixa eu pegar aqui o que você escreveu RP RP 100 da Hon eu vou vou trazer para você algumas informações sobre tá legal eh Desculpa tá Não consigo eh saber dela agora como se fosse a sax da Ah cara interessante tá Talvez eu tenha alguma noção da sax da Agent porque ela tem alguma relação também com as colunas que a gente trabalha da Wats Tá eu vou falar especificamente sobre essa

esse mecanismo de separação dessas colunas na próxima aula tá tem uma coluna chamada AX da Wats c18 AX que tem dois tipos de mecanismo de de interação né consegue fazer tanto troca iônica quanto a interação hidrofóbica de diferentes analitos e aí você tem uma baita de uma separação para algumas classes de de de analitos cara super interessante essa coluna eu vou falar muito dela na próxima aula então talvez seja a mesma mas eu vou deixar anotado aqui vou pesquisar um pouquinho mais e eu te confirmo na próxima aula daí combinado beleza eh deixa eu só

aqui troca Maravilha perfeito pessoal é isso tá se ninguém mais tem pergunta aqui eu vou ficando por aqui satisfação muito grande Tá com vocês aqui obrigado por ficarem até o final obrigado pela contribuição de vocês também aqui nas informações um grande abraço a gente se vê não na semana que vem na semana que vem a gente se vê na aula do Bruno Carvalho e na semana seguinte daqui 15 dias nós estamos juntos novamente grande abraço Uma boa noite para vocês e boa semana