|AQI| Espectroscopia de Fluorescência

o Olá boa tarde boa noite ou bom dia dependendo do horário que você for assistir esse vídeo eu vou então dá início a nossa aula de espectroscopia de fluorescência né A então hoje a gente basicamente encerra né as técnicas de espectroscopia mais comuns né na verdade não né falta infravermelho então onde assim aplicado mais a inorgânica né então a gente é e não finaliza mais já tá da parte inorgânica aí quase que encerrada né as técnicas de espectroscopia na então a gente viu as técnicas de absorção e emissão e dentro dessas duas desses dois grupos

a gente conseguiu desmembrar em algumas técnicas específicas né hoje a gente vai falar da espectroscopia de fluorescência que é uma técnica muito interessante né com uma aplicabilidade bem variada não só para inorgânica mas também para orgânica né vocês vão ver por exemplo que conceitos da química de coordenação né que a gente estudou enquant estarão bem envolvidos né com as técnicas de fluorescência A então é uma um tema muito interessante da gente poder discutir com grande aplicabilidade tanto na indústria quanto na o desenvolvimento tá é a primeira coisa que é importante a gente começar a se

localizar com relação aos termos né é muito comum as pessoas falarem fluorescência fosforescência às vezes falando como se fosse a mesma coisa ou falando luminescência né um termo também que é bem falado aí as vezes as pessoas acabam ou associando né como a mesma coisa ou simplesmente dizendo que é totalmente diferente quando na verdade a gente precisa localizar né os termos e as definições que são estabelecidas né Então a primeira coisa que eu queria era fazer essa organização desses conceitos tá então Vamos definir o que é luminescência primeiro porque todos esses processos fluorescência fosforescência AC

Milan a bioluminescência todos eles fazem parte de um grupo maior tá que é chamado de luminescência Então luminescência seria nosso grande grupo que envolve esses fenômenos de emissão espontânea de luz tá então a gente de acordo com a iupac a luminescência ela definida como a emissão espontânea de radiação por uma espécie que se encontra em estado excitado né então cuidado às vezes quando a gente fala emissão espontânea você pensa assim a nossa ele espontaneamente ele emite radiação não mas percebo aí eu pago e definir isso muito bem à emissão espontânea de uma espécie que está

no estado estado Então para que essa espécie vá para o estado estado alguma energia precisa ser fornecida para ela né que aquele conceito que a gente e eu não espectroscopia atômica tá E esse estado citado ele pode ser decorrente de um meio eletrônico ou vibracional tudo bem embora né Muito trabalho se refere a emissão da radiação como sempre fosforescência e fluorescência a recomendação que existe é que todos esses termos eles estejam descritos dentro da luminescência na Então na verdade o que que isso significa significa que a fosforescente a fosforescência é um fenômeno luminescente a fluorescência

também elas estão dentro do grupo da luminescência né então Normalmente quando a gente não sabe exatamente o que está acontecendo com mais se a fosforescência e fluorescência e como você resolve esse caso dizendo que é uma luminescência porque dentro da luminescência Você pode ter a fosforescência Ea fluorescência Tudo bem então aqui não já estão um fluxograma demonstrando essa divisão nessa separação então a gente tem um grande grupo da luminescência dentro do grupo da luminescência a gente pode ter a foto luminescência tão foto vem da onde de fotos né então basicamente eu tô dizendo o seguinte

que eu vou promover a luminescência da minha espécie por excitação através de fotos ou seja luz tudo bem E nós temos aqui me luminescência que a ideia é muito parecida só que a inveja Hospital minha mostra por fotos eu vou fazer a situação dela através de reações químicas tudo bem existem mais grupos tá bem entre a luminescência mas eu ganhei fazer os dois que para as técnicas de espectroscopia São mais interessantes Tá mas a gente pode ter outros fenômenos também como a thermoluminescence A Essência cuja a forma de excitação foi o calor tá então são

outras possibilidades né que existem mais o foco vai ser em cima dessas duas técnicas na verdade em cima da foto luminescência aqui meu eu só vou comentar dentro da foto luminescência a gente pode separar em fluorescência e fosforescência né então agora sim ó a gente tem essas duas formas né de emissão espontânea do Estado excitado dentro das técnicas del dos fenômenos de fotoluminescência tá lembrando né a gente vai discutir isso melhor mas já vou falar a a diferença básica né da fluorescência fosforescência é o tempo desse fenômeno tão a fluorescência normalmente ela vai acontecer de

forma muito rápida então eu vou excitar a minha mostra né normalmente no Ultra Ah e Assim que eu parar de citar mostra ela já para também de florecer já fosforescência não se ou cessar a minha fonte excitadora a fosforescência ainda permanece por alguns poucos segundos né então a diferença entre as duas técnicas né Aos dois fenômenos Desculpa aí com relação a esse tempo de decaimento da emissão de luminescência tá Oi e aí o exemplo né só alguns exemplos de fosforescência por exemplo Então são aqueles aquelas peças plásticas né que se cola na parede em quarto

de criança dormente ou de adultos nem nada conta para que durante o dia né ele fica e recebendo radiação inclusive radiação ultra-violeta né E aí quando você desliga tudo ele começa a brilhar só que ele demora mais para esse brilho sumir né Isso também serve para placas de segurança né Por exemplo teve uma uma noite que eu tava eu fui o último a sair da Etec e desligaram todas as luzes da escola e sem perceber que eu estava no laboratório E aí eu só conseguia andar direito pelos corredores por causa que eu olhava essas placas

né porque elas ficarão iluminadas não é mesmo depois que a luz tenha sido apagada né Há um tempo maior né então ela também é muito útil para essas placas de saída de emergência principalmente no momento que você tá né num momento perigoso e tá tudo escuro tá e a gente tem a quimioluminescência né a quimiluminescência gente o melhor exemplo e vocês já inclusive viram lá no laboratório né uso do luminol né então aqui a gente tem a reação que acontece do luminol né no meio peróxido quando a gente faz isso no laboratório né e o

que acontece com a espécie né que no final ela vai fazer o que ela vai emitir luz num determinado comprimento de onda percebo eu não for nesse energia na forma de luz pelo mineral não eu simplesmente fiz uma reação com ele e nesse processo de reação eu consegui fazer com que o luminol se transformasse no em um aminoftalato que é um estado excitado do luminol vamos assim bom e que quando ele fosse para o seu status fundamental ele liberasse essa energia na forma de luz né Isso é representado né dessa forma Percebo o luminol ele

é muito interessante porque ele também reage com a com sangue né então o que que acontece uma das possibilidades de aplicação forense do luminol você consegue fazer a marcação por exemplo do pessoal que normalmente né comete crimes ou acidentes enfim é não vou entrar nesse mérito mas que de alguma forma né no local sei lá Esse colchão por exemplo ele manchou de sangue a pessoa vai lá lava lava lava mas ela não consegue tirar tudo né então embora mancha visualmente tem assumido ainda existem algumas moléculas né um dos componentes do sangue que estão aqui ainda

E aí quando a gente borrifar uma solução de luminol luminal reage com essas espécies E aí através do uso né de um mantendo né o local escuro altamente a gente consegue visualizar essas corações essa luz que é emitida né É óbvio que aqui a gente também pode melhorar essa visualização também utilizando luz negra né outra violeta para aumentar essa emissão Tá mas em tese ela acontece já com a própria reação é o princípio daquele luminescence EA fluorescência né a que eu trouxe um exemplo da aplicação da florescência na microscopia lá então vocês que estão fazendo

microbiologia mas vocês não sei se tu já tiveram ainda e nas mexer no microscópio que no caso vocês vão mexer com microscópio mais simples mas a gente consegue aplicar a fluorescência nos microscópios né que são chamados microscópios de fluorescência Ah e por quê que é interessante porque é muitas espécies moléculas com funções biológicas possuem inflorescência né Ou seja você consegue esse talasco ultra-violeta elas vão Florescer isso é muito comum então a gente aqui é uma imagem de microscopia foi obtida né E na verdade em 3 comprimentos de onda que foi emitido né E foi feito

separadamente para cada uma dessas espécies né que tá sendo demonstrada foi jogada luz no ultravioleta numa radiação específica a gente já vai discutir sobre isso E aí quando eu jogo uma determinada radiação alguns compostos desta célula por exemplo que é uma célula tumoral ela floresce azul se eu mudo o comprimento de onda de excitação outras espécies florais o e outras vermelhas e aí depois é só colocar uma imagem sobreposta a outra e a gente tem isso aqui como o resultado final aqui a gente tá vendo o processo de divisão né de uma célula c******** no

caso o DNA tá em azul né que você percebe que a sala já tá né no processo alcançado e de separação uma proteína tão proteína verde e os microtúbulos dessa estrutura tá são vermelho tá então a gente consegue ver as três situações pra gente consegue localizar na tela através da fluorescência e onde estão determinados compostos de interesse isso para estudo na área de biomedicina bioquímica biologia molecular é algo extremamente interessante tá bom então gente como que é o princípio da luminescência né como que acontece a Eu já mostrei na verdade nessa representação nos nas aulas

anteriores mas vou retomar tá Eu até comentei com vocês que não merece eu não ia discutir muito porque a gente já tem uma aula específica para isso é o caso agora estou percebo não luminescência o que que a gente vai fazer a gente vai pegar Nossa mostra a gente vai incidir a radiação sobre ela tudo bem só que a gente vai incidir essa radiação num determinado comprimento de onda e aí o que que vai acontecer com essa mostra ela vai luminescer ou seja ela vai emitir luz para todos os lados certo além dessa luz que

ela vai mentir para todos os lados que normalmente vai ter uma comprimento de onda diferente da radiação incidente a gente já vai entender porquê é a gente também vai ter a própria radiação que passou pela mostra sem ser absorvida ou seja é radiação transmitida então aqui a gente vai ter dois processos na verdade né Um dia porção em um de emissão a porção é da radiação que a gente jogou na mostra não é parte dela vai ser absorvida mas também tem a emissão né de uma radiação de comprimento de onda diferente normalmente um comprimento de

onda maior né a que vai ser essa radiação que vai ser de interesse para a gente na luminescência tudo bem E aí dentro do de um diagrama a gente consegue ver o a gente ter situação do elétron né só que se Eletro ele acaba passando por processo né de perda de energia entre a níveis excitados E aí quando essa energia e retorna dá uma energia restante retorna ela vai retornar com uma energia diferente daquela que ela que ele recebeu né porque diferente porque ele já perdeu alguma coisa aqui ó tá então por isso que os

comprimentos de onda da excitação e da emissão são diferentes porque nesse processo de absorver e emitir existem perdas de energia se a espécie está perdendo energia nesse processo é óbvio que a energia que ela vai emitir é diferente da recebida tudo bem isso difere um pouco né daquilo que a gente discutiu na questão atômica na questão atômico A gente fala né olha a radiação que a espécie atômica vai receber é a mesma que ele vai emitir mas a gente tem que lembrar que o átomo é mais simples do ponto de do ponto de vista de

níveis energéticos né porque a uma espécie só Oi gente fala em moléculas que é o caso da luminescência né Eu estou falando de várias espécies próximas com aproximação entre orbitais onde essas transições podem acontecer né com perda de energia e tudo mais e aí a energia que sobra acaba Tendo sempre menor do que aquela que é recebida tudo bem isso não espectro de emissão vai aparecer na forma de bandas também assim como a gente viu nas outras técnicas tá só que nesse caso como são estruturas moleculares na maioria dos caso Então essas bandas vão ser

um pouco mais largo né a gente vê o que existem diferenças entre as bandas atômicas e moleculares e bom então para a gente poder complicar um pouco mais eu trouxe esse esse diagrama né que a gente chama diagrama de jablonski na ele é muito famoso na área de fluorescência e luminescência porque ele é a nossa forma de explicar essas transições que tá acontecendo né é de certa forma o diagrama ele tá aqui Resumindo né mas para luminescência a gente precisa verificar Uns detalhes um pouco mais aprofundar tá então o que que acontece aqui no diagrama

de jablonski a gente tem o estado fundamental e os estados esse tá tá a gente né Vai chama esses s0 de estado fundamental simuleto tá E S S2 S1 singleto também só que são estados excitados do Senhor e tu tá e a gente também tem o estado tri preto tá E também o resultado eu não a minha ideia não é discutir com vocês o que é o estado singleto com profundidade ou tri preto tá eu só vou comentar nem vou exigir isso de vocês como algo que vocês precisam saber no ensino técnico mas para vocês

entenderem que são estados excitados Tá qual que é a diferença entre os indireto e o tri Preto né a diferença do singleto e triplica o basicamente é o seguinte nos dois a gente vai ter de emparelhamento dos elétrons né E aí o que que vai acontecer no estado singleto ele costuma ser um estado mais favorável de acontecer o permitido como a gente diz né na área química porque porque orientação do Spin desses elétrons eles se mantêm independente do emparelhamento tá já não está do tripleto não o que que acontece o espinho por exemplo esse aqui

que deveria estar para baixo no Insta tripletta ele fica para cima tá ou seja há uma mudança de orientação do Spin eletrônico tá então essa diferença básica entre estado singleto básica tá gente existem outras questões envolvidas mas para discussão de hoje já é o suficiente Então a gente tem ou é essa diferença né entre os indireto e o tripleto tá o estado tripleto normalmente ele é considerado né mais difícil de acontecer que eu tô aquele dito hummm hummm hummm hummm estado não permitido né mas ele pode acontecer tá ele é mais difícil mas ele acontece

é justamente por conta dessa dificuldade que vai justificar o fenômeno da fosforescência por exemplo então o que que acontece aqui a gente vai ter né os nossos elétrons que vão ser citados a eles vão pular para os Estados indiretos excitados certo Ah e eles vão pular para diversos níveis que que acontece a gente pode ter nesses processos né uma certa perda de energia de um elétron que tá pulando de um ou de um nível né acima pulando para um nível abaixo mas que ainda é um nível excitado que está representado por essas flechinhas vermelhas e

que ela significa o significa os processos de relaxamento vibracional Ou seja a espécie tá perdendo né energia né por conta de processos de relaxamento vibracional né a gente quando for estudar infravermelho a gente vai entender o que que são esses relaxamento vibracionais mais basicamente é por vibração da própria estrutura né que vai acontecer então ela vai perder essa energia só que ela continua ela se mantém no estado excitado né a gente tem que lembrar que o estado citado a gente tem vários níveis Além disso a gente pode ter a chamada conversão interna ou seja o

elétron pula de um estado sem leite para um outro estado sem leite né Por exemplo quando a gente tem aproximação de espécies de uma molécula é normal que a gente tenha sobreposições de orbitais Então são processos possíveis tá E aí o que que acontece pode ter também relaxamento vibracional certo ou seja ai energia que eu fornecer para o meu sistema como ele está sendo parcialmente perdido ainda no estado excitado quando chegar o momento desse elétron retornar prestar do fundamental a energia envolvida já não é igual a energia que ele recebeu então houve perda de energia

nesse processo então a de ação que vai ser emitida ela não vai ser igual a por vida justamente por conta dessa Oi e aí é meio Óbvio tá gente se uma espécie receber uma quantidade né de energia ela e ela vai ter perda de energia nos níveis excitados é normal que a energia que vai ser devolvida no retorno ao estado fundamental seja menor nunca maior tá sem energia Vai ser menor a gente tem que lembrar lá da equação de energia e energia e comprimento de onda é e não é proporcional né na verdade é indiretamente

proporcional então o que que acontece se eu tiver menos a energia eu vou ter que o comprimento de onda maior tá então é isso que acontece normalmente então a gente fornece energia a desculpa a gente vai ver o termo inversamente proporcional né então se ele vai perder uma ele vai receber uma quantidade de energia né E essa energia Vai ser menor o comprimento de onda vai ser maior tá então eles são contrários na verdade então o que que acontece nesse processo normalmente nós fornecemos energia na região do ultravioleta que é uma região altamente energética né

com comprimento de onda mais baixo e a espécie vai devolver nessa energia na forma de fluorescência e com uma energia menor portanto no comprimento de onda maior que tende a ser no estado o no na região do visível tudo bem e aí o que que acontece essas transições elas são muito rápidas elas acontecem de forma muito rápida porque elas são muito favoráveis de acontecer né É por isso que a flor a flor Essência ela cessa imediatamente quando a gente pára de fornecer energia no ultravioleta Então se você for na estrutura Violeta ela floresce assim que

você tira o ultra violeta ela para de florecer né E isso acontece porque essas todos esses fenômenos acontece de forma muito rápida tudo bem no entanto o que pode acontecer é que parte dessa energia acaba em passando por processos de cruzamento entre sistemas ou seja eles acabam modificando do seu status inglês já está tripleto né lembrando né que a diferença do Estado sem leite para outro Preto primeiro o tripleto normalmente é um estado de menor energia onde você tem uma mudança da orientação do Spin eletrônico tudo bem só que todo esse processo ele é mais

demorado para acontecer então se ele é mais demorado para acontecer significa que todo o processo de fosforescência também vai levar mais tempo para acontecer então o que que o que que a gente tem que na fosforescência quando terminou de fornecer a radiação no outro Violeta e né paro de fornecer essa radiação a fosforescência mantém né o meu sistema ainda por um longo tempo assim em termos de luminescência tá gente está falando de algum segundo tá se você pensar fluorescência e é menos que eu não segundo então a fosforescência ela demora um pouco mais para acontecer

e portanto a gente consegue verificar isso visualmente tá então a gente basicamente é o diagrama de já bom que ele explica né esses processos EA diferenciação entre a fluorescência E fosforescência então a gente tem que lembrar de todas essas transições que podem acontecer né Essa esses relendo os relaxamentos e cruzamentos a gente tem processos que acontecem por conta até de colisões entre as a nossa espécie é fluorescente ou fosforescente e as moléculas do solvente do Meio onde essas espécies estão né a própria colisão pode causar um maior relaxamento ou mais cruzamento então e ele também

tem importância no resultado final de fluorescência e fosforescência Oi e aí só representando né a partir de uma animação a gente teria o equivalente né então receber uma pessoa receber energia para conseguir né passar por um para o ponto mais alto dessa estrutura né que ele precisa de uma grande quantidade de energia é em parte dessa estrutura tem uma escada onde essa pessoa ela consegue né descendo as escadas ela usa um pouco dessa energia que ele recebeu para isso mas chega num dado momento que ele vai ter que ir dar um salto E aí quando

ele dá o salto ele devolve os energia que é uma energia a perceba menor do que aquele que ele recebeu não é porque porque parte da cirurgia já foi Perdida na etapa da escada né E isso aqui também é representado junto com um diagrama de jahbulon na em pó porção as radiações de emissões não radioativos é no caso que estão não emitem luz e aí por fim a luminescência E aí o gente aqui nesse caso percego a gente tá falando luminescência né só para não ter que especificar se a flor Essência ou se é a

fosforescência Oi e aí Só para deixar bem mais claro né A questão da diferença entre a fosforescência E fluorescência então a gente tem a durante um determinado tempo a gente fornece energia na forma de luz né no outro Violeta só que quando é o sucesso essa energia as espécies fosforescentes elas vão diminuindo essa a emissão só que por um longo tempo né já fluorescência não quê que acontece assim que eu parei de fornecer energia ela de forma muito rápida já não tem mais nenhuma fluorescence tá então essa esse gráfico É bem interessante porque ele demonstra

qualquer diferença né entre fosforescência e fluorescência Oi e aí a gente agora começa a discutir também as espécies químicas né que são responsáveis por esses processos de luminescência E aí para essas espécies a gente dá o nome de fluoróforo né que a gente pode utilizar a mesma analogia daquilo que a gente aprendeu sobre os cromóforos né então basicamente é um componente de uma molécula uma região de uma molécula um grupo de uma molécula que é a responsável para que essa espécie seja fluorescente Ou seja que passe por todos esses processos de transições que a gente

exemplificou no diagrama de jahbulon a gente pode dividir os fluoróforos em dois grupos os fluoróforos intrínsecos que emitem luz naturalmente então aquele exemplo inclusive da microscopia né que eu falei para vocês são os aminoácidos Aroma A clorofila entre outros né então são espécies que naturalmente então se eu pegar fazer uma extração de clorofila e jogar radiação infravermelha ultravioleta nela Ela vai naturalmente devolver essa energia na forma de luminescência ou fluorescência nesse caso tá a gente também tem os fluoróforos extrínsecos então eles são adicionados à mostra Então são compostos estão normalmente são compostos na maioria deles

sintéticos que são adicionados à mostra como uma sonda então uma sonda no caso fluorescente ou seja para a gente marcar uma determinada espécie que a gente queira ver ou quantificar então por exemplo é muito comum usar né espécies fluorescentes para marcar bioma Oi e aí depois a gente consegui ver no microscópio então exemplo é roda mina A fluoresceína tá então são agentes que eles com eles conseguem se ligar a estruturas específicas de uma célula e naturalmente não teriam a por essência e aí quando a gente vai observar num microscópio de fluorescência a gente consegue localizar

essa espécie tá isso é muito comum né na área biológica na área de biologia molecular aqui a gente tem estrutura da roda mina percebam né que é uma estrutura grande né então isso é uma característica inclusive que a gente vai verificar nos compostos fluorescentes nos floral por usar de forma geral e aqui é aparência da solução de rodamina né Mesmo assim aberto né com a luz normal a gente consegue ver que ela tem uma intensidade né um pouco diferente de uma solução normal é óbvio quando a gente subir a sua radiação é ultra-violeta numa um

comprimento de onda específico de excitação da roda mina e só que tende a Florescer tá E aí E como que é estrutura do equipamento a estrutura do equipamento ela não é muito diferente daquilo que a gente viu no processo de absorção na verdade é uma diferença tendo em mais tem é muito importante na fluorescência bons equipamentos normalmente a gente chama eles de flor e metrôs tá então são os nomes comuns que a gente tem por equipamento o que a gente tem é uma lâmpada uma fonte tá aqui o exemplo tá com arco de mercúrio mas

tem o arco de xenônio que é o mais utilizado atualmente né para que para fazer a emissão Aliás a a emissão Tá certo né de uma radiação que Seja especifica ou né se eu quiser fazer um uma varredura para ver qual como a espécie se comporta em termos de excitação então a gente consegue selecionar vários comprimentos de onda a partir dos Filtros e fendas que a gente tem um sistema justamente para fazer essa separação do comprimento de onda de interesse e aqui a gente tem a célula onde vai ser colocada a cubeta né a a

cubeta gente ela eu coloquei a apresentação dela aqui Perceba o que ela é diferente da cubeta de absorção molecular tradicional porque normalmente na coberta de absorção molecular a gente só precisa de um lado e o outro lado oposto como os lados né lisos vamos dizer assim ou seja onde a radiação vai passar E por quê Porque na terça molecular eu vou avaliar a radiação que tá entrando em relação à que tá saindo só que sempre no ângulo de 180 graus só a radiação vem e passa sem mudar o seu ano tudo bem qual que vai

ser a diferença agora na florescência na fluorescência não adianta eu querer analisar aqui com o detector à frente da célula por quê Porque nesse caso o detector ele receberia radiação que não foi absorvida né que passou pela mostra sem ser absorvida e também a radiação da fluorescência vocês tem que lembrar que aqui são dois processos acontecendo é luz que não foi absorvida pela mostra o ilos de florescência imagina o detector recebendo essas duas radiações então ele ia ficar bem doido para conseguir processar tantas informações então o que que a gente faz para resolver esse problema

não luminescência radiação está sendo emitida para todos os lados então a gente coloca um detector de da radiação de fluorescência a 90 graus do meu sistema por quê Porque a 90° eu não vou ter essa radiação transmitida eu só vou ter radiação de fluorescência então para o meu detector processar esse sinal é muito mais fácil tá por isso que a cubeta da fluorescência precisa ter os 4 lados iguais porque porque de um lado vai ser avaliado a radiação de excitação ou seja Quais foram os comprimentos de onda que a minha espera é preciso absorver para

excitar e do outro lado a 90° eu vou estar avaliando a radiação que ela é mentiu né então é comum na fluorescência a gente obter sempre dois espectros um espectro de excitação ou absorção porque no fundo a mesma coisa tá e um espectro de emissão que vai ser a emissão da inflorescência tá para isso a gente precisa ter dois dois caminhos ópticos né um para avaliar excitação o outro para avaliar a emissão Oi aqui é a estrutura do equipamento tá um equipamento básico de um fluorimetro percebo que ele não é muito diferente ele é um

pouco maior do que um espectômetro normal de absorção molecular e ele também tem uma região para colocar cubeta então é muito parecido com um espectrofotômetro de absorção molecular tá ó e aqui os espectros que a gente o que treinar então como eu comentei com vocês são dois espectros que a gente consegue obter né um de excitação ou absorção que aí sim azul por exemplo tá no caso da do perileno e um de emissão tudo bem Perceba o que eles são muito parecidos né eles são muito parecidos ó outro exemplo um kilino né que a gente

vai discutir um pouco mais depois da frente então a gente tem o espectro de absorção e o espectro de emissão ou seja percebam né essa espécie aqui ó menino ele absorve em torno de 350 né o máximo de absorção dele ele precisa absorver né esse comprimento de onda para poder emitir e em 470 mais ou menos né então no na fluorescência a gente sempre vai trabalhar com dois conselhos a radiação né o o comprimento de onda para eu e citar amostra e o comprimento de onda para eu emitir né então no próprio equipamento a gente

vai precisar definir isso se eu quero obter o espectro de emissão então quê que eu vou fazer eu preciso dizer para equipamento qual vai ser o comprimento de onda e essa espécie e cita para isso eu ou busco na literatura para saber né Um dia minha espécie tem o máximo de absorção ou antes da análise de emissão eu faço uma análise de absorção que seria o tradicional aquilo que a gente já conhece da proporção molecular então eu jogo radiação na uma espécie beijo onde ela absorve né então esse conceito aqui vocês já é bastante neodi

absorção definido onde ele absorve aí a gente vai dizer para equipamento a equipamento eu preciso que você agora jogue na minha mostra a radiação do 350 nanômetros porque é nesse comprimento de onda que a gente consegue obter o máximo de fluorescência da nossa espécie E aí a gente faz toda a nossa análise a partir da sua fluorescência né então percebam gente é uma técnica interessante pode ficar um questionamento o seguinte né bom se eu posso analisar uma espécie pura por porção para quê que eu vou analisar fluorescência de percebam absorção ele é um fenômeno que

vai acontecer com diversas espécies e se você tiver uma mistura né Por exemplo aqui com quinino e outras coisas pode ser que seu isso a opção não fique tão bem definido por quê Porque essas outras espécies podem absorver radiação nessa mesma região e é comum na verdade que isso aconteça certo já a fluorescência ela não é né tão comum a todas as espécies então o que que acontece se eu tiver o que me no no meio cheio de outras espécies pode ser que só o que Nino Florença então o que que eu faço ao invés

de fazer a minha análise toda por absorção eu faço pela fluorescência porque a fluorescência ela não acontece para todas as espécies ela é uma técnica extremamente sensível existem casos né descritos na literatura é onde um equipamento consegue detectar fluorescência da presença de uma molécula no meio né num determinado o volume e isso é uma sensibilidade enorme que a gente não encontra para os processos de absorção então na fluorescência O Grande Lance de se fazer o espectro de absorção é mais pra gente descobrir qual é o comprimento de onda de excitação da nossa espécie fluorescente Tudo

bem então é importante que a gente deixa isso claro Ah e não sei se vocês devem ter percebido os espectros né que a gente discutiu no slide anterior eles uso de emissão e de aspersão Eles são muito parecidos né isso bem isso acontece para algumas moléculas né e a chamada a regra do espelho né E essa regra diz exatamente o seguinte que o espectro de absorção tende a ser né parecido com espectro de esse emissão então aqui a gente tem um exemplo né Então nesse exemplo percebo esse pico aqui que aparece na porção é o

responsável por esse pico na na emissão esse aqui verdinho é o responsável pela emissão de si e assim por diante então eles são espelhos um do outro tá só que assim gente é embora isso seja uma regra ele em várias exceções tá principalmente porque quando a gente tem mais geometrias moleculares Diferentes né entre o estado excitado estado fundamental ou quando a gente tem né A bandas de florescência que acabam surgindo de partes diferentes das moléculas da no estado fundamental no estado excitado do estado fundamental para estado excitado né então assim ao próprio meio pode né

contribuir com essa diferença do espectro então Existem várias coisas que torna-se diferente então por exemplo Às vezes você vai fazer uma análise não é porque o seu espectro de emissão saiu é um pouco diferente do absorção que tá tudo errado não são fenômenos que podem acontecer eles tendem a sério mas parecidos Tá mas existem questões particulares de cada espécie ou do Meio onde as espécies se encontra que pode modificar essa e em termos de estética em Oi e aí um outro outra questão que também né a gente precisa discutir é o chamado deslocamento de estou

eu imagino que vocês devem ter reparado que nos espectros que a gente discutiu né a gente tem normalmente os espectros de absorção colidindo né o sobrepondo parte do emissão né E aí o que que acontece a gente tem espécies onde esses espectros são mais separados existem espécies como aqui no caso do Quirino ou espécies o caso do perileno que ele é mais colado né vamos ver assim essa distância que existem entre os espectros de absorção excitação a&s emissão é o chamado deslocamento de stokes né então por que que isso acontece gente é bem simples e

nós já discutimos utilizando o diagrama de jablonski a a radiação de emissão ela sempre tem uma energia menor né um foto com menor energia em relação à a excitação então o que que vai acontecer é te esperar que quando a gente for colocar isso no gráfico de comprimento de onda eu tenha né um fenômeno de deslocamento para o meu espectro porque a energia envolvida na emissão é menor do que a energia envolvida na situação né e é óbvio que isso acontece de forma proporcional então é inclusive é de se esperar né pela regra do espelho

o que ele seja muito parecido só com deslocamento de comprimento de onda tá E por que que interessante né discutir isso quando a gente faz trabalha né com fluorescência é sempre desejável né que a gente tenha uma boa distância ou seja um alto deslocamento de stokes entre a emissão Oi desculpa a excitação EA emissão né para que a gente não tenha né a problemas até com relação ao tempo né de análise então quando a gente tem essa distância um pouco maior a gente tem uma diferenciação melhor desses espectros Para efeito de definição da nossa análise

tudo bem E essa distância então ela é chamada de deslocamento de estou tá então tem espécies que tem um pequeno deslocamento tem espécies que tem um alto deslocamento tudo bem E aí e o outro termo quilo tem de aparecer né nos estudos e é bom a gente discutir rapidamente é o termo de rendimento quântico de fluorescência né então quê que é basicamente o rendimento quântico né Ele é a razão entre o número de moléculas que florescem e o número total de moléculas excitadas obviamente que se o número total né de moléculas excitadas foram igual ao

número de moléculas que florescem esse valor tende a ser um né porque eu vou ter o mesmo valor dividido pelo outro tá E ele é um como se fosse um dado para a gente poder fazer comparações entre as espécies para saber se elas florescem bem ou se elas florescem pouco tá isso é importante para efeitos analíticos tudo bem em termos né matemático e apresenta essa esse rendimento quântico pelas constantes de velocidade tá então a gente o símbolo né de rendimento corte com esse e a gente representa né pela pela constante velocidade de primeira ordem para

relaxação de flor por flor Essência dividido pela soma de si mesmo valor mais a constante velocidade para relaxamento não radioativo ou seja aquilo que foi perdido por por outras transições que não emitiram fotos tá eu não vou cobrar na só tô mostrando matematicamente como se calcula tá a ideia principal aqui é explicar o que é esse termo rendimento quântico e como que a gente vai usar isso e a para discutir sobre a capacidade de uma molécula não emitir fluorescência e Oi e aí a gente vai usar aqui inclusive então a existe existem questões da estrutura

molecular que influenciam a fluorescência existem o primeiro delas é o seguinte normalmente compostos com Anéis aromáticos tem uma emissão fluorescente mais intensa e mais útil né no sentido analítico embora outros compostos orgânicos também apresentem né inclusive com duplas ligações conjugadas mas ainda assim aqueles que possuem Anéis aromáticos tendem a ter uma emissão de fluorescência maior além disso a fluorescência oxinox perimetralmente é que a fluorescência é muito mais favorecida em moléculas mais rígidas Ou seja a gente tá falando daquelas moléculas que tem anéis condensados eu percebo E essas espécies aqui peridinina o show fenilpirrol eles não

tem flor Essência tá no entanto se a gente o verificar essas espécies né Essas estruturas numa molécula condensada Aí sim elas passam até fluorescência então aqui no Lina isoquinolina ou indol tá outro exemplo né eu tenho floreno que tem um rendimento quântico de um EA bifenila lá que estão rendimento código de 02 ela vai Florescer mas ela floresce muito pouco mas quando Eu convenço de alguma forma ou não é aqui na verdade eu tô tornando a espécie mais rígida Então eu tenho um aumento da fluorescência tudo bem há outros fatores que vão influenciar temperatura solvente

PH Tudo bem então a temperatura Já fechou ruim da temperatura o seguinte ela aumenta a gestação né do seu meio suas moléculas ficam mais agitadas portanto elas tendem a sofrer mais colisões nisso que elas sofrem mais colisões há uma maior probabilidade acontecer aqueles fenômenos de relaxação que eu demonstrei no diagrama de jablonski nesse caso vai ser uma relaxação colisional ou seja decorrente de uma colisão e isso vai fazer com que não dê tempo para essa espécie ou não ter energia suficiente para que ela floresça né ou se florecer vai florecer muito pouco porque boa parte

da energia que ela recebeu ela tá perdendo por uma emissão que não é radioativa ou seja não tem a missão de foto e isso diminui a fluorescência Outro fator é a viscosidade gente a viscosidade pelo menos no sentido né isso tende a tornar né a aproximação das espécies né maior né Por por conta da viscosidade ou né muitas vezes a viscosidade acontece por conta da mudança das espécies do meio né que tem bem a colidir com a sua espécies E aí você acaba perdendo a eficiência da fluorescência PH também PHP influência então PH como ele

o PH em estruturas orgânicas tende a mudar relativamente um pouco a estrutura Você tem uma mudança do comportamento e da dos níveis né energéticos de excitação e isso pode levar ou a uma mudança é só mãe termos de aspecto do seu espectro como a gente pode verificar aqui então mais Pérsio ela se eu for mudando PH a gente percebe que ela muda o seu esperto porque as transmissões que estão acontecendo só um pouco diferentes tudo bem E isso pode ser ruim porque eu posso tá diminuindo a intensidade da minha flor Essência Tudo bem então é

sempre esperado a gente trabalhar com ph né que sejam favoráveis para fluorescência é porque além de mudar a estrutura né o PH também ele pode influenciar na intensidade da fluorescência estão se a gente pegar o quinino por exemplo e e colocar em ph6 a gente nota que já não há mais fluorescência para ele então é muito comum na análise de quinino a gente usar o meio a certificado porque para gente aumentar ou diminuir o PH desculpa e assim aumentar intensidade de fluorescência tudo bem então percebo Se eu por exemplo usar 450 nanômetros que é a

o comprimento de onda de excitação do quinino o e avaliar o a variação do PH o que o nosso é isso né quando eu tenho ph2 eu tenho a minha maior intensidade de fluorescência conforme eu vou diminuindo o PH aumentando desculpa PH eu vou tendo uma diminuição da intensidade da fluorescência tudo bem Oi e a fluorescência né eu comentei na abertura da aula Ela é muito interessante do ponto de vista dos compostos de coordenação por quê Porque lembra que eu comentei que a rigidez da estrutura favorece A fluorescência então quando uma espécie formam um complexo

né na formação do complexo a um enrijecimento estrutural e por conta desse enrijecimento ele passa a Florescer e umas vezes por exemplo aqui espécie não florescente da 8-hidroxiquinolina ele passa a Florescer Se eu jogar zinco no meio porque ele passa a formar um complexo eu posso usar isso inclusive como um fator de análise para determinação de zinco né porque o ligante sozinho não floresce o ligante com e do coordenado ele passa florecer Então isso é um fator né de análise que eu posso utilizar o meu favor e aí quando a gente fala de fluorescência e

compostos de coordenação Não eu não tenho como deixar de falar sobre os compostos de terras-raras né então quem são as trans raras trançar ação a as espécies que pertence a esse grupo aqui ó que normalmente Ninguém liga né para ele que ele fica fora da Tabela Periódica fora assim só demonstração né que são os lantanídeos né o grupo dos lantanídeos né eles são chamados de terras porque é Normalmente eles são encontrados como óxidos e antigamente se dava o nome de terras a óxidos né e raras porque eles são elementos pois não é muito difíceis de

serem isolados separados por que esses compostos eles têm propriedades física é muito parecida né isso acontece por um fator né que um dia vocês vão aprendendo não cabe agora explicar mas chamado de contração lantanídica tá por conta disso eles tem os raios atômicos muito próximos e por isso às suas propriedades são muito parecidas tá E por que que eles são interessantes né porque as terras-raras né esse grupo de de átomos né do grupo dos lantanídeos eles são naturalmente né fluorescentes só que assim na se você pensar na sua estrutura inorgânica Ou seja quando essas espécies

estão na forma inorgânica o rendimento quântico de luminescência deles é muito baixo muito baixo mesmo então se a gente for usar para aplicações né na indústria ou na o desenvolvimento trabalhar com eles na forma inorgânica não é muito legal porque a flor eflorescência é muito baixo né No entanto se eu trabalhar eles na forma de complexos eu aumento eficiência desta luminescência e eles têm um rendimento quântico extremamente alto e eles formam complexos muito estáveis muito fáceis principalmente porque são espécies grandes e portanto Elas têm um espaço Granja né ou seja ele tem espaço para comportar

de 6 a 12 ligações coordenadas na então a gente tá falando aí de muita coisa se a gente pensar até o máximo de 12 então 12 pontos de coordenação que a gente pode fazer dessas espécies com ligantes com agentes quelantes né E aí a gente tem várias aplicações né na área biológica na área de e são biológica né na área é de por exemplo na parte de naquela identificação de notas falsas né dinheiro falso a aquele aquela aquelas partes que costumam Florescer né normalmente são usados complexos de terras-raras tá porque você pode inclusive e trabalhar

com diferentes cores média inflorescência Então isso é bem interessante né na área de LED por exemplo é muito utilizado não é composta de terrara então eles têm uma aplicação muito boa né a gente quem tá mais por dentro das notícias sabe né que já existe uma guerra comercial né entre Estados Unidos e China por conta do domínio da tecnologia de terras-raras porque a cada vez mais vem se descobrindo novas os sonhos e aplicações na área tecnológica que são muito interessante tá Ah e por quê que é legal trabalhar né consolar também a gente usou terras-raras

primeiro né na questão da espectroscopia Eles são muito interessantes porque eles tenham deslocamento de stokes muito alto eu percebo a excitação né acontece também no Ultra Violeta e a gente vai ter a emissão acontecendo sol lá na frente no visível né Isso é muito interessante eu tenho diferentes comprimentos de ondas para diferentes lantanídeos e então eu posso ter uma diversidade o maior das cores que eu vou querer trabalhar tá porque cada espécie vai emitir em comprimento diferentes né um longo tempo de decaimento Ou seja a fluorescência desses compostos tende a ser um pouco maior do

que o normal né então isso acontece e não é para não é grande maioria o európio que tem um pouco mais né então a gente percebe aqui que o tempo de decaimento ele é um pouco long Ele ainda tá dentro do grupo dos fluorescente tá ele ainda é rápido né no sentido de luminescência mas dentro dentre o grupo dos fluorescentes ele é o que leva mais tempo Então esse foi extremamente importante dependendo daquilo que eu quero aplicar o meu fluoróforo Oi e aí vem aquela questão né eu comentei que os as terras raras na sua

forma inorgânica eles não florescem muito bem já se eu coloco eles um complexo aí a luminescência é muito mais Evidente então gente isso acontece por conta de um efeito que nós chamamos de efeito antena né então é feito antena o que que acontece a gente coloca o nosso com a nossa até Rara e complexa ele com um ligante orgânico um quelante tudo bem o que vai acontecer é que alguns quelantes eles absorvem radiação do ultravioleta muito bem e aí o que acontece como eles estão ligados agora um composto terra rara eles recebem as energia e

transferem de forma muito mais eficiente as energia o centro metálico ou seja até Rara agora tá recebendo uma quantidade de energia muito grande então quando eu falava que a terra rara na forma inorgânica não floresce muito bem é porque ele não consegue absorver com eficiência radiação que ele recebe já se eu uso uma antena ou seja um composto orgânico quelante ele absorve essa radiação e transfere para o centro metálico né como que ele faz essa transferência hora por aqueles diagramas né a de jablonski com você para você então existe aquelas transições que acontecem né e

Inter sistemas então aqui é o que a gente vai observar né E se vocês separar a espécie orgânica tá funcionando como uma antena né ele capta o sinal e transfere para o centro metálico AL e esta espécie que está recebendo essa essa energia vai devolver E aí ela vai devolver naquilo que ela faz de melhor que através da fluorescência tudo bem Então esse é um princípio muito interessante para aumentar eficiência não é o rendimento código de fluorescência dos Riam terras-raras Oi e aí eu trouxe um exemplo para vocês né de uma aplicação por exemplo na

análise de suspensão de nanopartículas né então aqui dentro das cobertas tem Suspensões né então a gente está falando de partículas sólidas nesse caso né para florecer se a gente pode usar né também para análise de suspensão porque lembra a gente tá vendo a radiação a 90 graus no fluorímetro então a gente consegue ver a radiação emitida de forma tranquila E aí aqui a gente tem dentro das cobertas se vocês repararem são cobertas com os quatro lados lisos e a solução quando a gente observa ela ela é incolor né ela não tem cor nenhuma nessa suspensão

aí aqui nessa foto a cubeta a foto foi tirada com e já no fluorímetro e já com fecho de luz ultra-violeta passando nela Então perceba que onde passa outra violeta aparece a cor característica daquela ano partícula né E essa nanopartículas são nanopartículas que tem um polímero polihidroxibutirato que foram dopadas com esse complexo de terra rara né então onde está passando laser né com a radiação ultra-violeta aparece a cor de emissão característica Dessa espécie né e aqui a foto lateral só para gente ver com pouco e aqui a foto né por cima né Eu percebo visualmente

eu não tem cor mas quando eu passei né o peixe tinha citação eu consigo ver qual é a cor característica da minha história é e também legal e para análises quantitativas a gente pode trabalhar por essência de duas formas ou os métodos diretos ou os métodos indirectos o que que são os métodos diretos na verdade os métodos diretos sol basicamente pegar o meu analito de interesse e formar né um ligar ele é um agente complexante para formar um complexo fluorescente o que aquele caso do zinco né que eu comentei com vocês então é o método

direto eu pego um hálito reajo ele com um complexante que no final o produto final vai ser um completo complexo fluorescente e nós podemos também utilizar métodos indirectos onde a gente avaliou que o decréscimo de fluorescência então a gente por exemplo tem um analito a um analito que atende a super super e Mirna suprimir a fluorescência na de forma geral então o que que eu faço eu misturo esse analito com o reagente que já é naturalmente florescente que que vai acontecer outro mais analito eu colocar menor vai ser a fluorescência do meu sistema porque ele

tende a sua o primeiro a minha flor essência então é uma forma e Alice tá analiticamente gente a Florescer E se ela pode ser usada né na inorgânica EA orgânica e na bioquímica né ela tem aí uma aplicações diversas em todas essas áreas então a uma técnica muito Ampla né então por isso que ela é muito interessante do ponto de vista analítico E aí para gente poder encerrar esse assunto eu trouxe um estudo de caso para uma análise quantitativa né no caso eu usei aquele que é o mais tradicional que análise de sulfato de quinino

em Água tônica tá então essa aqui é a estrutura do quinino o que menino ele é obtido né Ele é extraído de uma planta chamada cinchona é a que essa aqui né da Imagem e aí o que que a gente precisa como que a gente faz né uma análise por flor e meter ia ela segue basicamente o mesmo roteiro que a gente viu aqui das técnicas já trabalhar né é o primeiro preparar uma as soluções padrões então a gente precisa estabelecer Qual a relação do sinal de florescência com a concentração para isso o melhor né

É você fazer soluções padrões então a gente prepara soluções padrões tão mesma coisa a partir de uma solução estoque a gente faz tem o branco que não vai ter que Nino e a gente faz soluções com diferentes concentrações dessas soluções estoques a gente faz várias diluições e depois definir os comprimentos de onda da análise e aí entra o que é um pouquinho diferente em ela só que a gente viu porque aqui a gente vai precisar descobrir o qual é o comprimento de onda de excitação do quinino então é muito comum que que a gente faz

pega uma das nossas soluções padrões e faz o espectro de absorção ou excitação que é esse roxo aqui ó tá então o que que a gente nota que ele tem um em torno de 347 nanômetro tudo bem Então a partir daí agora sim a gente pode fazer as nossas análises porque a gente vai dizer por equipamento para ele manter fixo análise em 347 nanômetros por quê Porque daí eu vou conseguir montar o melhor o espectro de emissão tá ou espectro de fluorescência do Kinho Oi e aí o que a gente vai fazer então a gente

pega todas as soluções padrões em amostra e já vai ler direto aonde no 300 Z750 que ele recolhe a minha meu resultado em termos de comprimento de onda de emissão tão em vez de fazer o espectro de emissão para todos os padrões eu já posso pedir para o equipamento fazer a leitura só naquele que eu sei que é o maior comprimento de onda né de maior emissão tudo bem Oi e aí fazendo análise nessas condições eu tenho aqui os resultados apresentados depois a gente vai com dados dos padrões só montar a curva de calibração tudo

bem igual às outras técnicas eu vou obter a equação da reta e o é o quadrado com a equação da reta a gente vai pegar o valor de inflorescência da mostra e substituir aonde no Y né que Away Tom se refere a fluorescência substituindo eu vou chegar nesse valor aqui de 02 85 MG por litro Só que tem um detalhe amostra lida ela foi obtida a partir de uma diluição que é uma diluição de 1 para 100 né então o que que a gente precisa fazer fazer a conversão né De acordo com a diluição se

a gente for em conta a gente nota que amostra original tem 28,5 miligramas por litro de quinino Tudo bem então a gente tem que ter que ter cuidado com essas coisas porque normalmente a amostra ela foi obtida a partir de uma diluição aí quando você termina de fazer esta conta você já acha que essa Concentração da amostra não cuidado ela é a concentração da solução da amostra eu preciso fazer o cálculo para chegar na concentração na mostra tal qual tudo bem E aí bom e é isso então então agradeço até mais