Bibliotecas genômica, cromossômica e de cDNA

o olá tudo bem com vocês bibliotecas bibliotecas são locais onde nós armazenamos a informação e maneira organizada ou seja nós temos diversos tipos de livros nós temos diversos tipos de sessões na nossa biblioteca nós conseguimos acessar a informação de um nível específico ou de vários livros mas por que que nós organizamos a nossa informação em diversos livros em um em um único sólido primeiro do que ele poderia ficar muito longo e eu simplesmente tem uma grande dificuldade de acessar eu mandei uma informação específica dado que o meu livro em si seria por si só muito grande então simplesmente porque ficaria quase que impossível de manipular esse nosso livro muito grande essas dois motivos aqui justificam a necessidade na nossa biblioteca vários livros e no único também justificam a necessidade de fragmentar mussum material genético produção de bibliotecas moleculares vamos combinar como isso pode ser realizado em oi gente falando nós vamos ter três tipos de bibliotecas as bibliotecas genômicas onde todo o genoma representado então vou pegar o meu genoma de interesse por exemplo um cromossomo circular aqui como parte desse projeto roma eu vou fragmentar eu vou como utilizar as pontas e vou ligar as mesmas em diversos vetores menores e agora invés de ter meu genoma todo aqui um como único fragmento eu tenho vários pedaços deles distribuídos entre diversos vetores outra possibilidade eu usei uma biblioteca cromossômica então invés de trabalhar hoje normal todo eu vou trabalhar com o cromossomo todo de um determinado espécie tão sensual carioca que tem esse cromossomo aqui e maneira análoga que o nosso genoma procariótico que tinha apenas um único cromossomo nesse caso eu faço a mesma ideia vou fazer uma fragmentação uma compatibilização de pontas e uma ligação que vai produzir aqui diversos plasmídeos isolados a outra possibilidade é fazer uma biblioteca de cdna de dna complementar que vai representar todos os genes que estão sendo transcritos na forma e na abundância no momento da coleta do nosso material o quê que isso quer dizer por acaso o coleta um determinado o tecido fígado e o outro tecido ruim eles expressam genes diferentes então abundância desses nossos livros na nossa biblioteca faz variar é como se eu tivesse um best-seller o maior quantidade e o outro livro é pouco vendido uma quantidade muito baixa ou até mesmo inexistente que vai variar também e se por acaso tem uns alternativas display sempre um tem nesses próprios genes que produzem diversos transcritos a partir do mesmo produzindo diversos não fique se eu vou ter essas diversas variações ali presença minha biblioteca e o próprio play simcity já é um ponto que vai modificar dado que eventualmente voltei a junção de éxons ali em uma determinada região e essa junção jackson o conteúdo da nossa biblioteca percebam aqui então que eu tenho várias cores aqui são representadas por exemplo fragmentos produzidos de dna complementar decoração vermelha que vendo rna mensageiro vermelho e coloração amarela de coloração azul de coloração roxa percebam que eu tenho aqui o vermelho ou vermelho funcionado com o verde pensando que eu tenho muito do vermelho eu tenho muito pouco daqui desse azul piscina que olhar a minha biblioteca produzida que ao lado eu vou ter muito do nosso vermelho eu vou ter pouco nossa piscina eu vou ter essa combinação do vermelho com verde aqui também então a biblioteca de dna complementar do seu dna ela representa a abundância ea variação dos transcritos presentes em um determinado momento em uma determinada espécie como que eu posso fragmentar pensa numa biblioteca de dna genômico inicialmente vamos imaginar que eu tenho o meu genoma como um todo eu tenho aqui sítio de restrição de uma enzima um chamado de azul de uma enzima dor chamada de vermelho a última a probabilidade gente pode pensar aqui para uma enzima que corta com 6 pares de base eu tenho 4 x 4 x 4 até formar quatro vezes 10 a sexta eu tenho total ali de 4. 096 possíveis combinações de ar tcg quando diferente sítio sendo que apenas uma delas é reconhecida por é coisa que a combinação gat3 e assim eu vou ter um sítio de corte a cada 4. 096 sítios de pares de base um genoma genoma randômico a expectativa nossa série obter mais ou menos um sítio de corte a cada 20 4.

576 bases linhares nesse nosso já não assim sendo eu vou cortar aqui aleatóriamente esse nosso material se eu tiver uma única em cima eu vou produzir algo como aqui em cima percebam um sítio mesma hora que um fragmento maior aqui o fragmento menor que o outro pagamento maior olha aqui por acaso combinar em cima uma enzima dois com aqui embaixo eu vou produzir o fragmentos mais homogêneos em menores durante esse processo é definir o meu setor que vai ser utilizado na montagem na minha biblioteca para decidir qual o tipo de estratégia de clivagem com enzimas de restrição eu vou utilizar que eu vou utilizar uma estratégia que todos os fragmentos muito longos dependendo do tipo do meu retorno e não vai conseguir carregar esses alimentos se eu trabalhar com vetores muito curtos eventualmente eu poderia acertar o escolhi um vetor mais simples mas se de fácil manipulação laboratório ou então utilizado um vetor que não permita fragmentos tão pequenos como se nós pensarmos por exemplo numa biblioteca que vai ser utilizada com bacteriófago lambda ela não vai tolerar faremos um pequeno eu preciso escolher a minha estratégia de fragmentação de acordo com o tipo de vetor que eu vou utilizar outra possibilidade também é fazer uma digestão com enzimas que reconhece apenas quatro pares de base só vai ser a nossa consequência eu vou ter aqui 4 x 4 x 4 x 4 4 a quarta o que dá grosseiramente ali 256 possibilidades de combinações de ar tcg assim eu vou ter um sítio de corte a cada 256 sítios de quatro pares de é isso quer dizer que grosseiramente ali no genoma randômico eu vou ter um sítio de corte a cada 1024 fora de base logo eu vou produzir fragmentos muito muito muito melhores do que os nossos anteriores porque eu tenho sítios mais presentes no nosso renome e o que vai trazer dois problemas esses alimentos muito pequenos eu já muitos clones ou seja muitas cópias muitos livros na nossa biblioteca para representar o genoma como um todo então nós vamos utilizar essa digestão completa aqui por exemplo com sal 3 a 1 que tende a ter seco reconhecimento de vários fragmentos pequenos pois se não fizer uma digestão completa se por exemplo eu fiz uma digestão parcial com sal televisão tem uma digestão parcial ou eu coloco óleo em cima de uma situação química que não é tão adequada eu posso modificar a temperatura que ela tua eu posso modificar esse ambiente químico que eu já mencionei ou até mesmo tempo dessa nossa restrição faça um tempo mais curto então não vai conseguir cortar todos os sítio da mesma e vai gerar uma dia é parcial ou seja ela não corta todos os sítios e não importa de maneira aleatória assim a gente pensar em uma cópia do genoma e tá vai produzir um fragmento pequenininha aqui a gente pagamento um pouco maior porque ela não cortou nessa posição um fragmento mais curtinho aqui o fragmento uma hora ali isso em uma cópia porque eu não vou ter só uma única cópia do fenômeno tubo em uma outra cópia eu posso um modificar esse padrão de gestão e aí eu vou ter a mesma região a mostrada de distintas maneiras na nossa biblioteca e mais que isso a mesma região presente em diversos cones em diversas composições e a utilização de sal 3 a 1 foi proposital autorizam tem quatro pares de base não é muito difícil você encontrar um dna plasmidial que não tenham sítio para as autorizam eu ficaria muito difícil manipular e fazer a ligação já que ela produz fragmentos são coesivos com bangão então o que acontece você faz uma fragmentação do genoma com salto ele não pega um vetor aqui que tem um sítio de clivagem com banga um e faz a ligação de um certo sal três não como nós o privado com branca um aí você consegue atender a situação de biologia molecular em que você precisa ter um sítio no que não sei o próximo para não estragar o mesmo no momento que você tá cortando e ligar com essas nossas pontas compatíveis aqui de braga uma outra possibilidade também é fragmentar de maneira física por exemplo eu posso nebulizar o meu dna onde eu vou adicionar uma alta velocidade no mesmo com uma pressão que empurra esse nosso líquido que impacta aqui em cima de mim impacto seja pequenas gotículas que acabam com pena dessas nossas moléculas de dna isso pode ser feito também como a constrição planeta uma passagem de uma serrinha que você aperta e reduz ou então a utilização de ultrassom com formação de habitações que em podem isso gera um fragmentos em todas as nossas situações eu preciso compatibilizar as nossas pontas porque porque eu não vou fazer cortes bonitinhos e nem corte que sejam complementares uns com os outros eu preciso vou deixar todos os cortes sem nenhuma ponta sim cunha tô doente ou sem nenhuma conta 13 é preciso lindíssimas e modificação das pontas do dna mas agora eu já cortei o meu genoma ou melhor vou decidir como eu vou cortar o meu genoma em quantos pedaços eu preciso cortar o mesmo para utilizar e produzir uma biblioteca que a mostre adequadamente teve esse processo ele é aleatório que nós podemos calcular probabilidades em cima dessa nossa área autoridade e estimar para mães precisar equação de cabo corpos que nós teremos que é a nossa probabilidade de comer tudo já não é fiel um tamanho médio do fragmento que eu vou utilizar na biblioteca você vai ser um fermento em mim parte de base de um pagamento de dez me parte de base mg é o tamanho do nosso genoma ou seja o tamanho do nosso problema tá vendo aqui nessa nossa forma com dois lotes nós queriamos aqui que nós vamos ter vamos imaginar que eu tenho uma situação em que eu quero o tema por idade de noventa e nove porcento de cobrir todo o genoma de um procarioto como aqui uma bactéria eu vou ter aqui um fragmento de mil para demais você já vou fazer uma peteca cozinha e eu tenho aqui quatro pontos seis milhões de pares de base como o tamanho do nosso genoma atualizando aqui a nossa aula de brasinha básica nós vamos ter um total de 21. 181 clones para serem avaliados 20 mil bactérias diferentes que eu vou ter que trança que eu vou ter que manter em cultura infeccionar e buscar nelas é uma quantidade relativamente grande mas poderia ser pior né 21. 000 até que dá para trabalhar agora vamos pensar no genoma humano aqui você tiver agenda arrumando eu quiser de novo trabalhar com 99% encobrir de probabilidade de ter já numa completa ou sendo representado fragmentos aqui de mil pares de bases só que agora três bilhões de pares de base no mesmo na uma completa fazendo aqui a nossa alma e abra novamente o número de cones que eu vou precisar obter será de 13 milhões 843 1843 cores agora 21.