Laboratório em Bioquímica - Dosagem de Proteínas pelo Método de Bradford

o olá nesse vídeo nós vamos aprender sobre a determinação do teor de proteínas totais pelo método de brad full e vai ser uma atividade da disciplina de laboratório em bioquímica coordenado pela professora doutora ana lúcia fontes freitas é o método de brejo é o método para determinação do teor de proteínas totais em uma amostra a e ele é baseado na interação entre proteínas que contém aminoácidos de cadeia as básicas ou aromáticas com corante como a cia blue resultando em um composto de coloração azul e já absorbância a595 nanômetros e para conduzir a esse ensaio o

primeiro passo a preparação do reagente de empréstimo depois devemos elaborar uma curva padrão utilizando uma proteína de concentração conhecida e realizar o ensaio utilizando uma proteína de concentração desconhecida por fim vamos quantificar a absorbância em espectrofotômetro devemos pesar o corante que umas e blue esse reagente é bastante fotossensível então vamos deixar o ambiente mais escuro possível para 200 ml de reagente de brejo devemos pesar 20mg de chroma cia blue e com auxílio de uma pipeta adicionou-se 10 ml de álcool etílico a essa solução deve ficar em agitação por uma hora e posteriormente colocamos o conteúdo

do bec em um balão de 200ml e depois devemos revestir o balão com papel alumínio 1 e agora precisamos adicionar 20 ml de ácido fosfórico 85 porcento ao balão posso ser um ácido da vemos manusear esse reagente em uma capela com os devidos cuidados e e então devemos completar o balão até o menisco com água isso pode ser feito com água destilada outra puro e depois precisamos homogeneizar o conteúdo do balão oi oi a gente precisa também ser filtrado três vezes para isso nós montamos o sistema com 3 fones em que a filtração ocorrerá de

forma simultânea lembrando que o processo deve ser feito com ambiente mais escuro possível e é necessário que ele esteja armazenada e eu faço com barra e no final da filtração devemos refletir o frasco com papel alumínio o e armazenado para uso posterior a validade do reagente é de 30 dias e após a preparação do reagente uma curva de calibração deve ser feita utilizando uma proteína pura como padrão de referência essa proteína ser a albumina sérica bovina conhecida como ubs a por ser uma proteína comercial e de baixo custo para isso iremos utilizar várias concentrações de

bs a inicialmente iremos fazer uma solução de 1 mg por ml dbs a pesando 10mg da proteína e de lume no em 10 ml de água é a solução deve ficar em agitação para completo de eluição da proteína e deve fazer diluição e seriados no primeiro tubo adiciona-se 500 micro litros de água destilada e vamos adicionando quantidades crescentes de água em cada tu é e agora vamos diluir abs a no primeiro tubo vamos adicionar 500 micro litros de v.sa e vamos adicionar concentrações decrescentes dbs a em cada turma é o volume final de água em

cada tubo será de 1 ml e vamos obter diferentes concentrações de bs a que variam de 5 a 50 microgramas por 100 micro litros agora nós vamos fazer a nossa curva padrão para isso nós vamos pegar sem micro litros dbs a em cada concentração e adicionar em um tubo de ensaio a cada concentração deve ser feita em triplicata e aí e aí e depois vamos pagar do nosso reagente de brad fu o e adicionar 2,5 ml de reagente em cada tubo de ensaio e vamos homogeneizar a solução a incubar por dois minutos como observa-se casa

mostre-se carão como a coloração gradual ficando cada vez mais azul à medida que a concentração de proteína aumenta e agora nós vamos realizar a medida de absorbância em espectrofotômetro a 595 nanômetros lembrando que é necessário primeiro zerar o aparelho com branco em que consiste em 100 micro litros de água ao invés da amostra e 2,5 ml do reagente e vamos também anotar todas as medidas de absorbância obtidas a comédia dessas medidas nós podemos criar nossa curva padrão e para isso nós vamos criar um gráfico de dispersão e adicionar uma linha de tendência linear e vamos

relacionar também a opção de exibir a equação da reta e o r no gráfico e nós obtivemos um rd 0.98 o que indica uma confiabilidade dos resultados agora que temos a equação da reta nós podemos calcular a concentração de outras proteínas e nós vamos fazer isso utilizando essa proteína de concentração desconhecida para isso nós vamos repetir o mesmo procedimento que fizemos para fazer a curva padrão adicionando sem micro litros da amostra em triplicata e 2,5 ml do reagente de brejo homogeneizar ano e quantificando a absorbância em espectro qual é a média de absorbância obtidas podemos

aplicar o resultado na equação da reta e obter a concentração de proteína o que era de 34.9 microgramas bom então é isso obrigado por assistir esse vídeo espero que vocês tenham gostado